分子生物学中RFLP、SNP、PCR、分子杂交、荧光定量PCR，他们的原理和使用方法是什么？

wolf

分子生物学中RFLP、SNP、PCR、分子杂交、荧光定量PCR，他们的原理和使用方法是什么？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/23584021

长长的路

特地回去找了本科时候看的课，中国大学慕课有华中农业大学的分子生态学，这个老师讲的挺清楚的，第三章的内容大部分都是你需要的。b站上就有。

卡卡

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检验医师

楼上们挺全，我捡漏说句荧光定量原理
荧光定量PCR通过检测每个PCR循环后双链DNA的量/增量并与标准曲线比对，从而得出目标片段的起始量（其实等同于每个循环后跑一遍胶看亮度）。SybrGreen EvaGreen之类的染剂是荧光剂-粹灭剂原理（evagreen是两个荧光剂连一起互为粹灭剂），游离时无荧光，嵌入双链DNA后荧光剂和粹灭剂离的远了产生荧光。这种反应要求灵敏度高噪音小，所以跑胶用的那些染剂（EB啊sybr safe啊gel red啊什么的）不适用。另外用evagreen的时候务必加reference dye，不然浓度低时跑出来的曲线跟天女散花似的，别问我怎么知道的。还有一种常用的探针是TaqMan，原理是在被检测位点上杂交一段DNA探针，两边分别带荧光剂和粹灭剂，在子链DNA聚合时探针会被顶走，顶走后探针发荧光。这个灵敏度特别高，相应的探针也不便宜。
至于标准曲线，有时候根据检测需求不同其实并不需要。如果要检测一个样本中目标片段的绝对浓度，那么标准曲线是一点要的。不过有时候我检测子代老鼠某基因是纯合还是杂合，就只需要阴性和两个阳性（纯合/杂合）做对照就行了，有时候没有已知的杂合对照就阴性和纯合也行，杂合的Ct会比纯合多一倍。至关重要的一点：样本一定要normalize浓度。别问我怎么知道的。
说到染剂，跑普通PCR的琼脂胶时别用gel red，片段长度越小越惨，条带跟瓷器的蚯蚓走泥纹似的。具体原因没确定，然而我怀疑是因为gel red的结构是把两个ethidium连在一起，两个ethidium分别插入DNA不同位置，于是把DNA拽弯了，导致有的地方跑的快有的地方跑的慢。不差钱用sybr safe，差钱用EB吧。染剂最好煮完胶后放稍微凉一点（60C上下，用手能拿住瓶子）再加，不然EB挥发很可怕，gel red和sybr safe会一定程度降解。跑完胶泡EB水我个人绝对不做，条带边缘会毛茸茸的不说，EB挥发我是拒绝的。如果胶里加EB的话时间跑的时间别太长，EB会往阴极跑，跑时间太久了EB都去缓冲液里了。别问我怎么知道的。

长长的路

谢邀，我看楼上挺全面，就少荧光PCR 了。荧光PCR指的是用特殊的荧光染料染上核酸通过PCR定量。有几种染料，比较精确的taqman是核酸探针，根据不同的目的基因进行设计再进行PCR反应。比较便宜通用的是sybr green，通过掺入核酸链之间来显色，通过PCR过程中检测荧光量来定量。

长长的路

刚好没事回答一下，若有不足，欢迎指正加补充
原理：

• RFLP（restriction fragment length polymorphism）：
  

DNA提取→用限制性内切酶酶切DNA→用凝胶电泳分开DNA片段→把DNA片段转移到滤膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分析。


在同源的染色体区段的DNA，用限制性内切酶切割，会产生不同的区段，之后用标记好的探针进行杂交，得到的图谱可以显示出各个区段的差异性。

• SNP(single nucleotide polymorphism):
  

是在基因组的水平上由单个核苷酸引起的DNA序列的多态性，SNP的位点在基因组中广泛存在，人类的基因组中一般500-1000个碱基会存在一个SNP位点。
通俗的说：就是染色体某段基因--DNA双链中，A,T,G,C哪个碱基不配对了

• PCR（Polymerase Chain Reaction）
  

以上就是PCR的原理图，主要就是以DNA 为模板，在序列的保守区域设计引物5‘和3’，加上一些作料（PCR所用的材料--聚合酶，引物，dntp，buffer ect）检测是否存在我们所需要的目的片段

• 分子杂交（molecularhybridization）确定单链核酸碱基序列的技术。其基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸（叫做探针）间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA与DNA，RNA与RNA，或DNA与RNA之间进行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同类型的杂交分子。
  

下班了~~~先到这

更新一下，谢谢大家关注。


一页照不下。










大多来自百度百科。好久没写笔记了，其实挺难写的。其中细抠有很多地方自己也不是很明白，有机会扩充。