走进ELISA 之 ELISA原理知多少？

非诚勿扰孟非

ELISA全称为酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay )，是当前应用最为广泛的一项定性/定量检测抗体（抗原）的免疫酶技术。
基本原理

ELISA是将抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合而发展起来的一种综合性技术。固定在载体表面的抗原或者抗体不会失活，仍然保留其免疫反应性。酶标记的抗体或者抗原既具有免疫学活性，还具有酶的催化活性。在实际检测时，首先将抗原或者抗体固定在固相载体上。然后加入检测对象，让待测物质与固相化物质结合，形成固相化的“抗原—抗体”复合物。再加入酶标记的抗体或者抗原，与固相化的复合物结合，形成酶标复合物。最后加入底物溶液，发生酶催化底物显色反应，根据颜色深浅进行定性或定量分析。

了解完原理后，接下来我们来认识一下ELISA大家庭中的主要成员吧！
说到家庭，首先要认识一下居住环境，也就是大房子，ELISA家庭的大房子可是精装修呢，我们把它命名为固相载体。
固相载体在ELISA实验中作为吸附剂和容器，最常用的材料是聚苯乙烯，它能较强吸附蛋白，可用于吸附抗体（原）且仍能保留其原有的免疫学特性。
成员一
包被用的抗原（体）,进行ELISA反应的第一步就是将抗原（体）固定在固相载体上，是通过抗原（体）自身结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团之间的引力结合完成的。然而，它们之间的结合可不止这么简单，还会受到抗原（体）浓度、包被温度，包被时间，PH等的影响。
成员二
酶标抗体（原），它是ELISA中关键试剂之一，既要求有酶催化活性，又能保持了抗体（原）的免疫活性，当遇到相应的底物时，可以催化底物反应生成有色产物，作为我们进行结果分析的重要依据。
成员三
洗涤液，在整个ELISA的实验中，需要进行多次洗涤，避免引起非特异吸附，要想保证能达成我们的最终“目标”，洗涤液可是必不可少的一个成员。
成员四
终止液，光听这个名字大家也就清楚它的功能了，就是终止反应，也就是站好我们这个ELISA大家庭的最后一班岗。
就像每个家庭一样，成员间配合模式也是不同的，根据不同的配合模式，主要可分为四种类型，每一种类型各有优缺点，下面为大家详细介绍。

01
间接ELISA
间接法常用于检测抗体，将抗原固定于固相载体上，首先加入检测抗体与抗原特异性结合，随后加入酶标二抗检测并利用底物显色，通过颜色深浅进行结果判读。
优点：只要更换不同的固相抗原，就可以用一种酶标二抗检测各种与抗原相应的抗体，目前使用较为广泛。
缺点：存在交叉反应的可能性，抗原纯度不够会导致非特异结合，产生假阳性。



02
竞争ELISA
竞争ELISA既可用于检测抗体，也可用于检测抗原。以检测抗体为例，将抗原固定在固相载体上，首先加入待检抗体，再加入酶标抗体，则待检抗体就与酶标抗体竞争结合包被在固相载体上的抗原。通过洗涤洗掉未被竞争结合的酶标抗体，最后加底物显色，需要注意的是显色结果与待检抗原（或抗体）的量成反比。
优点：可用于检测不纯的样品，且数据再现性高，特异性好。
缺点：操作方法更复杂一些，产品性能取决于抗体的亲和力。



03
双抗体夹心ELISA
此方法常用于检测抗原，将抗体固定在固相载体上，首先加入待测抗原与抗体特异性结合，随后加入酶标抗体检测并利用底物显色。
优点：抗原无须事先纯化，进行操作时不需稀释。
缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。



04
双抗原夹心ELISA
反应模式与双抗体夹心法类似。将固相抗原和酶标特异性抗原分别取代固相抗体和酶标特异性抗体，就可用双抗原夹心法测定样品中的抗体。
优点：该方法不受非特异性IgG的干扰，背景干扰小，受检抗体不需要稀释。
缺点：技术难度较高，需要制备高质量的酶标抗原。



相信大家现在已经了解了ELISA的基本原理及方法学了，也想必大家有藏着一个小疑问，ELISA家族都是用来检测抗体（原），但是又有哪些指标评估ELISA试剂盒的质量呢?

01
特异性
特异性简单来说就是阴性样本的阴性检出率，要保证这一点首先就需要做到与其他检测抗体（原）无交叉感染，并且保证阴性样本检出的准确性。
02
灵敏度
灵敏度简单来说就是阳性样本的阳性检出率，一方面能够反映出试剂盒对于被检物质的最低检测能力，另一方面需要保证阳性样本检出的准确性。可通过我们自身待检物质的性质进行选择，如果我们待检物质浓度量很低，可以选择高灵敏的试剂。
03
精密性
又可称作重复性，一般而言，对于ELISA试剂盒而言，板间及板内精密性可控制在15%以内。有些ELISA试剂盒精密性可达到10%以内。
04
稳定性
稳定性是试剂盒必须有的基本属性，是指试剂（盒）在有效期内和规定条件下保持其性能的能力，一般有效期稳定性、运输稳定性、以及冻融稳定性。
05
操作简便性
同样对于ELISA的操作简便程度大家也是非常关心的，操作时间以及操作步骤也是我们在选择试剂盒过程中需要考虑的问题，在挑选试剂盒上也别忘了这一点哟~

以上就是小V对于ELISA原理、方法学，性能指标的介绍，相信大家都有所收获了，其实ELISA蕴含的知识及魅力可不止这些，若想详细了解，后续我们的走进ELISA系列会带大家更多相关分享。

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