实验干货分享！从分子克隆到细胞转染全解析

生物科研实验室

一、从分子克隆到细胞转染全解析
通过表达或者敲低来探究基因对功能的影响，是细胞生物学中常用的手段，荧光蛋白的发现也为研究追踪细胞的动态和变化提供了有效的工具。因此，将某个基因引入细胞系，或者在细胞系中敲除/敲低某个基因，不可避免地需要历经转染这个过程。

功能完整的质粒需要从分子克隆开始精心设计，避免造成功能元件的缺失或者异常。本文从分子克隆讲起，阐述如何构建一个在哺乳动物细胞中正常表达的质粒，以及如何将该质粒传递（转染）到细胞系中。

二、分子克隆

分子克隆的目的是将自己想要表达的基因安装在表达载体上，这样表达载体转染进细胞后能够启动目的基因的表达。因此，表达载体或质粒，需要包含必要的几个原件来启动目的基因的表达，同时便于细胞转染后的筛选。
三、质粒的基本组成部分

完整的质粒通常包括：启动子（promoter，用于启动目的基因的表达），目的基因(GOI)，终止子（terminator or polyA，用于终止基因的表达），复制起始位点（ori，用于质粒的扩增，真核表达载体有的包含两个复制起始位点，包含质粒在大肠杆菌中扩增的 ori 和 f1 ori），抗性基因（用于在大肠杆菌和细胞中筛选阳性克隆）。
分子克隆

分子克隆类似于打补丁，把从其他地方获取的目的基因通过 PCR 或者酶切的方式获取，并粘贴到一个所需的表达载体上。因此整个过程涉及 PCR，酶切，片段回收，连接转化，测序，质粒扩增和抽提。以 Takara 的 In Fusion 为例：

1 PCR

PCR 的目的是为了获取能够用于连接的目的基因，通过两端引物的扩增得到自己想要的目的序列，在此过程中能够通过引物的设计添加或者删除酶切位点，引入突变位点等。需要注意的是，如今市场上多种多样的高保真酶能够确保碱基突变的概率极低，甚至能够用这些高保真酶扩增长片段、高 GC、多序列重复的载体序列。

2 酶切

获取的 PCR 产物需要插入到自己的表达载体上，通常质粒为超螺旋闭环状，因此需要合适的限制性内切酶切开对应位点，以方便目的基因的插入。切开的质粒通常需要回收骨架部分，舍弃掉原来位置上的基因。建议使用 NEB 家的限制性内切酶，没有星号活性，Buffer 基本通用，能够灵活地调节和控制酶切反应及时间。对于没有想要的酶切位点的载体，可以利用步骤 1 中的 PCR 方式获取。
3 片段回收

为了获得高纯度，去除反应液中的离子，通常需要 DNA 琼脂糖凝胶电泳来回收酶切或 PCR 得到的目的基因和载体（胶回收）。通常最后的洗脱用去离子水或者双蒸水，以方便下一步的使用。

4 连接转化

常用的分子克隆手段众多，如普通的酶切连接（依赖 T4 DNA 连接酶），In Fusion（依赖于外切酶），GoldenGate（依赖 TypeIIS 型限制性内切酶创造的独特切口），Gibson 组装（外切酶，聚合酶，连接酶同时作用），CPEC（高保真 DNA 聚合酶）等。连接转化后的产物通常转化到感受态细胞中，以获取单克隆。
5 测序

重组得到的单克隆菌落有时会有错配或者突变，碱基的缺失等，因此需要挑选单克隆菌落测序。通常测序前会通过菌落 PCR 和酶切验证，但是如前所述，现在的 DNA 高保真聚合酶大大减少了突变的发生，而目前的连接方法组装正确率都很高，因此为节省时间，我选择平板随机挑选两个菌落送测。

6 质粒扩增和抽提

测序成功的质粒可以重新转化感受态，挑取单克隆培养后选择小提/中提/大提质粒。值得注意的是，用于转染的质粒最好使用去内毒素质粒提取盒。
转染

1 转染前的准备

转染之前需要准备细胞，一般细胞复苏后传 1 - 2 代观察形态和状态，如果条件严格的话还需要检查是否有支原体污染或者黑胶虫等。细胞状态良好，形态完整活力较好，汇合度达到 80 - 90%后可以接种细胞。接种细胞前需要计数，有条件的推荐 RWD 家的细胞计数仪。

2 转染操作

经典的转染方式包括磷酸钙，脂质体（以 Thermo 的 lipo2000/3000 为代表），PEI （25, 0000 or 40, 000），慢病毒侵染等，每种转染方式大同小异，具体原理就不逐一赘述。以下以经济实用的 PEI 转染为例：
1 准备试剂

无血清培养基(DMEM or opti-MEM)，PEI (1mg/mL)，待转染的 DNA 质粒。

2 准备 DNA-PEI 复合物

以 24 孔板为例，500ng 的 DNA 稀释到 50ul 的无血清培养基中，然后按 1：3（1μg DNA : 3μL PEI）的比例加入 PEI （需要自己调试 PEI 的比例 1：1 - 1：5，和细胞类型和不同品牌的 PEI 质量都有一定关系），混匀后静置 15min，一次性将复合物滴入到待转染的孔。

3（可选）

6 - 8 小时后去除培养基，更换为新鲜的完全培养基（DMEM + 10% FBS）。

4 24 小时后荧光显微镜下观察转染结果，通常转染效率很高，大于 90%。