微流控解密：BioFire公司的FilmArray产品

二维码

第一部分：公司产品简介




图1.1：BioFire公司Logo

BioFire公司的FilmArray微流控芯片是目前已经成功商业化的微流控产品的经典之作，该芯片采用巢式多重PCR分析技术，对同一个血液样品进行一次测试便可以检测多达24种病原体，并且整个检测过程比传统PCR或RT-PCR方式要快得多，只需要大约一个小时的时间，非常适合于传染病的早期快速筛查。如下图分别是FilmArray测试仪器和芯片实物图。


图1.2：FilmArray测试仪器实物图及各结构说明


图1.3：呼吸道感染检测芯片及结构说明（图中液体仅仅为了可视化，实际测试芯片不含有液体部分）

目前，在BioFire公司官方网站上已经公布了四种测试芯片，分别是：呼吸道感染检测芯片，血液感染检测芯片，胃肠道感染检测芯片，脑膜炎感染检测芯片。虽然四种芯片针对的疾病不一样，所需要检测的样品种类也不一样，但是产品外观上基本一致，可以参考图1.3中呼吸道感染检测芯片的外观结构。

1，呼吸道感染检测芯片


呼吸道感染检测芯片是BioFire公司最早开发出来的产品，也是目前该公司发展最为成熟的检测芯片。早期的呼吸道感染检测芯片可以在一个小时之内检测多达20种不同的呼吸道细菌和病毒等病原菌。目前，该公司已经开发出基于FilmArray 2.0检测系统的新型呼吸道感染检测芯片，相比于早期的检测芯片，该新型芯片可以在45分钟之内完成测试，并且比早期芯片更准确，更高效，更快速，检测的病原菌种类也更多（21种）。如下为该新型呼吸道检测芯片可以检测的细菌和病毒种类：


图1.4：新型呼吸道感染检测芯片可以检测的病原菌列表

2，血液感染检测芯片


血液感染能引发全身炎症反应综合症，并可能发展为重度脓毒症和感染性休克，导致血液感染患者死亡率大大增加。此外，为了防止出现耐药性，临床医师必须尽早开始有效治疗且避免让患者过度接触广谱抗生素。因此，实验室快速鉴定病原菌以及耐药机制,对于选择合适疗法上极其关键。常规培养和药敏试验可能需要72小时才能出结果。

而FilmArray BCID Panel血流感染检测芯片可全面检测与血流感染相关的24种病原体靶标以及3种抗生素耐药基因，在血液培养标记为阳性（使用血液培养设备）后1小时内出结果。

该检测芯片主要针对病人血液中病原菌感染进行检测，可以同时对多达24中病原菌（包括革兰氏阳性菌，阴性菌，和致病酵母菌）和3种抗生素抗性基因进行检测。如下图为可以检测的病原菌种类。


图1.5：血液感染检测芯片可以检测的病原菌及耐药基因列表

3，胃肠道感染检测芯片


传统的胃肠道感染检测方法难以通过临床表现来确定具体的病原菌，临床医生只能通过细菌培养，同时对患者的粪便进行虫卵和寄生虫检测，但是该传统检测方法局限性比较多，比如测试时间长，需要3-5天才能得出结果，灵敏度低，需要专业技术人员才可以进行检测等。

FilmArray的胃肠道感染检测芯片可以对导致胃肠道感染的常见22种病原菌进行同时检测，同样，只需要1小时便能得出检测结果，该检测由仪器自动完成，不需要专业技能人员，也不需要复杂的细菌培养等实验环境。


图1.6：胃肠道感染检测芯片可以检测的病原菌列表

4，脑膜炎感染检测芯片


脑膜炎（meningitis）系指软脑膜的弥漫性炎症性改变。由细菌、病毒、真菌、螺旋体、原虫、立克次体、肿瘤与白血病等各种生物性致病因子侵犯软脑膜和脊髓膜引起。细菌性脑膜炎是一种特别严重的疾病需及时治疗，如果治疗不及时，可能会在数小时内死亡或造成永久性的脑损伤。

脑膜炎的实验室检查比较复杂，需要根据血象，脑脊液等进行细胞计数，并且还需要通过免疫法来对细菌抗原进行检测，其他的辅助检查手段还包括有X射线摄影检查，CT，MRI检查等，这些检查不仅加重了病人的疼痛程度，而且检测时间长，检测成本高。

而FilmArray的脑膜炎感染检测芯片则可以快速的（1小时），准确的（采用巢式PCR法）对导致脑膜炎的常见14中致病菌，病毒和酵母进行同时检测，这些病原菌会感染患者的中枢神经系统，在严重的情况下甚至能威胁患者生命。


图1.7：脑膜炎感染检测芯片可以检测的病原菌列表

虽然目前BioFire只有四种检测芯片发布，但是在不久的将来，会有更多的测试芯片通过FDA或CE的认证而面向更多种类的疾病检测。


图1.8：FilmArray 2.0系统是由多个FilmArray仪器组成的阵列

与其他POCT产品一样，FilmArray也是采用测试仪器和一次性测试芯片的模式来进行检测，但是纵观这四种检测芯片，FilmArray的产品相对于市面上其他疾病检测芯片来说，具有非常明显的竞争优势：

1，全面综合性强：该产品并非从单一的某种致病菌的角度，而是从整体的疾病的角度来设计检测芯片，这对于只出现某种症状而不清楚致病菌种类的患者来说，可以同时对导致该症状的多种致病菌进行同时检测，逐一排除筛查最终便可以定位导致疾病的病原菌，进而采取必要的治疗手段来治疗。这种同时检测多种致病菌的功能主要得益于芯片中多重PCR技术的实现。

2，快速检测：1个小时便可以得出检测结果的测试芯片在目前来说，非常具有应用前景。 3，特异性高，灵敏度高：由于测试芯片采用巢式PCR技术，故可以最大程度的排除其他非特异性病原菌核酸物质的干扰，同时两步PCR扩增也能够保证在极低病原菌含量的情况下也能快速的检测出来，从而提高了芯片的检测灵敏度。

第二部分：芯片内部结构剖析


虽然FilmArray芯片功能复杂，但整个FilmArray芯片可以简单分为两个部分，上面的储液管组和下面的反应层（由于其本质为具有多个密封泡的柔性塑料故命名为柔性袋）。其基本结构如下图所示。


图2.1：测试芯片由储液管组和柔性袋结构垂直塑封组成。

注意这两个部分并不是重叠排列，而是相互垂直排列，即将储液管组通过热塑封垂直封接到下部分的柔性袋。其结构类似于将离心管并排（储液管组）竖立粘接在一张水平放置的白纸上（柔性袋）。

2.1 储液管组的基本结构
储液管组是由12个具有特殊结构的储液管并列而成，该储液管的材质为PP，或其他具有一定机械强度的材料，能够在内部真空的条件下不会发生明显变形。储液管内部被抽成真空，便于内部固体试剂的长期保存和测试时液体试剂的吸入。每个储液管内部预装有不同的冻干试剂，所以实际上内部储存的并非“液体”，而是“固体”。在储液管组两端分别有样品入口和稀释液入口，用于加样。如下图为了观察方便使用红色或蓝色液体填充储液管。


图2.2：上层储液管组和下层柔性袋结构。

如图2.2，从图中左到右的顺序，各储液管中冻干试剂分别为：
1，过程对照材料（即裂殖酵母细胞，测试时同样经过细胞裂解，核酸提纯，巢式PCR，如果检测为阳性，说明仪器操作和化学过程正常，否则报错，不给出检测结果。）
2,-5, 清洗液，核酸纯化用。
6，核酸洗脱液
7，逆转录/PCR-I反应液
8，稀释液
9,10，PCR-II反应液，含LCGreen
plus+荧光染料
11，空，或稀释液？反应液？
12，空，用于收集PCR-II反应溢流液

在专利US8409508中公开了这种储液管组的基本结构以及使用真空吸取液体的原理和过程。如下图为单个储液管内部结构说明。单个储液管通过热塑封的方式与柔性袋贴合在一起，其中储液管底部与柔性袋内部的反应池相连通。储液管壁有两个开口，上面的开口为排气口，用于储液管封装时抽取内部的空气形成真空腔，下面的开口为试剂入口，一般为密封状态，刺破后试剂可被真空吸入。


图2.3：单个储液管内部结构说明。

单个储液管包括三个部分，储液真空腔，活塞，固定卡。其中真空腔用于维持芯片内部的真空状态，其内部往往预装有固体试剂；活塞用于在试剂被真空吸入真空腔后，将液体试剂推入柔性袋的反应池中，活塞表面必须光滑，且气密性好；固定卡则用于芯片封装时固定活塞位置，使其储液管内部维持真空腔且保持一定体积。

下图是12个储液管在该测试芯片上的并列布置结构图。该爆炸图可以清楚看出储液管的活塞结构，固定卡位置以及排气口和试剂入口的位置。


图2.4：12个储液管组成的上层储液管组的基本结构。

下图显示了封装时储液管被抽真空和测试时液体被吸入过程示意图，图中说明很清晰，故在此不做说明。


图2.5：单个储液管封装过程及测试时吸入液体过程示意图。

2.2 柔性袋的基本结构
下层的柔性袋在功能上主要包括四个部分：细胞裂解区，核酸纯化区，第一扩增区，第二扩增区。各个部分的具体结构样式并非固定，只要能实现各自的功能，也可以采用其他结构。如下所示为专利US8409508中公开的柔性袋的一种结构示意图。


图2.6：一种柔性袋的内部结构说明。

该柔性袋结构的材质是透明的涤纶/PP材料（或其他透明的柔性的薄的材质），其制备方法是将一层薄膜对折，然后使用热塑封的方式将不同位置加热密封，以此形成具有不同大小袋状的结构，这些结构分别构成了该测试芯片的基本功能单元：
细胞裂解区：用于样品中病原菌或病毒的裂解，使其释放内部核酸物质。
核酸纯化区：对核酸物质进行提取和纯化。
第一扩增区：纯化后的mRNA反转录或/和DNA进行第一步PCR反应。
第二扩增区：第一PCR反应完成后的扩增子在稀释后在第二扩增区发生扩增，同时高温裂解，获取每个微池中PCR-II扩增子的裂解曲线。


图2.7：柔性袋内部不同区域功能说明。

在柔性袋密封之前，三种不同试剂被预装到不同结构单元的不同位置，这三种试剂分别是：在细胞裂解池中预装有陶瓷微珠；在DNA纯化池中预装有冻干的硅胶磁珠；在第一PCR池中预装有第一PCR所需要的多种引物。如图2.7中所示

第二扩增区并非在柔性袋中通过热塑封的方式制备，而是另外一种材料制备的特殊结构，通过粘贴的方式贴合到柔性袋上。第二扩增区是由黑色的0.5mm厚PC材料制成，包括有102个微池，每个微池的体积为1uL。从下图可以看出该PCR-II反应池的基本结构及其内部预装的PCR-II所需引物。


图2.8：柔性袋中第二扩增区结构说明。

第三部分：芯片封装前处理


一般的，微流控芯片在封装之前均要进行前处理过程，前处理主要包括以下几个方面：
1，表面改性：即将表面全部位置或特定部位由亲水性改成疏水性，或者由疏水性改成亲水性，改性的方法有很多，此处不深入讨论。
2，样品处理：比如在双抗体夹心法测试芯片中，往往要将捕获抗体包被到芯片内部特定位置，或在别的测试芯片中，需要将液体试剂进行冻干处理，然后将冻干粉剂预装到芯片中特定部位再对芯片进行封装。

此处FilmArray芯片并没有表面改性方面的内容，其主要原因可能是芯片测试时不需要太严格的亲疏水表面性能。但是需要考虑的是，在测试时膜材料表面可能会吸附核酸或蛋白（如核酸酶），从而影响核酸的提取和纯化，以及后续的PCR扩增，但这一问题可以通过选择对核酸吸附较少的材料或对膜材料进行高温蛋白变性来解决。


图3.1：酶标板点样仪内部结构（与FilmArray无关，仅用于说明点样仪结构）。

在该芯片的封装之前，需要进行几个关键的样品前处理：
1，需要将研磨微珠，硅胶磁珠等物质预装到柔性袋中核酸裂解池和核酸纯化池中。
2，对柔性袋中第一扩增区进行引物固定，引物的固定方式是使用点样仪对第一扩增区内部进行点样，其参数可以直接由点样仪来控制。但需要注意的是，此处FilmArray测试芯片能够进行多种病原菌的同时检测，是由于该芯片的第一扩增区固定了多种不同类型的PCR-I引物，即多重PCR方式，采用多种不同类型的引物可以对样品中不同病原菌的DNA进行同时扩增，为PCR-II以及后续的裂解曲线分析做准备。
3，对第二扩增区进行巢式PCR的内部引物固定，同样采用点样仪点样方式完成。但此时第二扩增区中每一个检测微池中的引物可以相同也可以不同，这样每一个或几个检测微池就可以单独检测某一种病原菌的存在与否。


图3.2：FilmArray测试芯片第二扩增区不同微池可以点样不同引物以此可以同时检测不同病原菌。

第四部分 芯片的封装方法


由于整个FilmArray测试芯片包括两个大部分：储液管组和柔性袋，下面分别介绍这两个部分的封装方法。

4.1 柔性袋的封装制备
测试芯片下层的柔性袋是用两层柔性塑料薄膜制备而成，塑料薄膜的材料可以是聚酯，PET，PC，PP，PMMA，或金属铝箔等，两层薄膜通过加热密封的形式贴合在一起。
在加热密封之前，可以将各种冻干试剂，比如PCR引物（封装前已经通过点样仪点样到薄膜表面特定位置并干燥使其固定），研磨微珠，硅胶磁珠等预装到薄膜的特定位置，然后通过热塑封的方式将该两层塑料薄膜中特定部位封合在一起，形成各种不同反应池的柔性结构。


图4.1：第二扩增区是由黑色PC材料制备并贴合到柔性袋上。

柔性袋中第二扩增区可以认为是一个特殊的结构，因为该部分并不是采用上面类似的柔性袋特定部位热塑封的方式制备的，而是一种单独的结构，采用黑色的较厚PC材质制备而成，特定微池处由于需要进行荧光检测所以需要透明处理，如下为第二扩增区的组成结构，从中也可以看出该区的制备方法。
第二扩增区的制备方法是，先将该PC材料组成的阵列通过热密封的方式贴合到柔性袋上，再通过专用点样仪将PCR-II引物点样到各个微池的底部，加热或待引物固定后，反应阵列再通过刺破盖膜密封，该膜上有已经刺破的小孔，小孔位置和反应阵列的微池一一对应，然后通过压力敏感型粘胶层将第一膜和第二膜分别固定到第二扩增区的反应阵列中。


图4.2：第二扩增区内部结构说明。

4.2 储液管组的封装制备
储液管组是采用注塑成型的方式获取单个储液管的各个组件，比如活塞，固定卡等。然后在真空环境中将这些组件安装在一起。
一种方式是：在所有预装液体试剂都装载到储液管中后，在储液管顶部插入活塞，为了使储液管中真空腔固定，在活塞处插入固定卡，然后将整个储液管组放置到低压冻干仪中，在冻干过程结束后，原先的液体试剂也就变成了固体存储在特定储液管中，同时由于储液管组仍然处于真空环境，储液管内部腔室也被抽成真空状态，然后将储液管中真空口密封。
储液管封装完成之后就会和制备完成的柔性袋结构封合在一起，此时就需要通过热塑封的方式，将储液管底部封合到柔性袋上端开口处，使得储液管与下方柔性袋各反应池的结构一一对应。如下图可以看出储液管和柔性袋的封装过程。


图4.3：FilmArray测试芯片的封装方法示意图。

为了使测试芯片在长期保存过程中，内部仍然处于真空状态，芯片被封装在圆柱形铝罐中（就像鸡肉罐头一样？？）然后密封在铝质聚酯袋，这些封装过程必须在真空低压下进行。下图为封装完成之后的FilmArray测试芯片试剂盒。
芯片的真空包装具有三个重要作用，便于长期保存时维持冻干试剂的性能，样品和液体试剂可以被真空吸入方式进样，减少芯片中气泡的产生。


图4.4：封装完成之后的FilmArray测试芯片试剂盒。

第五部分 芯片的检测流程


在讲述芯片的检测流程之前，需要先讲述一下芯片内部液体的驱动力，和离心驱动，泵驱动等方式不同，FilmArray采用一种全新的气动囊泡结构来驱动，姑且将其命名为气动挤压驱动。
在仪器内部具有和FilmArray测试芯片中柔性袋各反应池一一对应的囊泡结构，可以想象，对某些囊泡进行充气，则囊泡会挤压柔性袋特定部位，从而使得该部位的液体流向其他未挤压部位，同理，如果对某个关键通道处进行充气挤压，则会完全封闭该液体通道，放气则会使得通道打开，如此便形成了该柔性袋中的挤压阀。这种囊泡结构的气动挤压促使液体均匀可控的朝向下一个反应池运动，同时由于挤压阀的存在，液体在柔性袋中的流动方向和流动体积则变得完全可控。

下图是仪器中与柔性袋对应的囊泡结构，通过对这些囊泡结构的充气和放气，便可以控制液体在各反应池中运动，完成例如细胞裂解，核酸纯化，巢式PCR扩增等基本反应。


图5.1：FilmArray仪器中用于挤压柔性袋的囊状结构示意图。

下图是FilmArray测试仪器的内部结构图，可以看出，整个仪器都是使用压缩气体来驱动的，而压缩气体上的阀门，以及哪一个部位应该充气或放气，则是由电脑程序来精确控制


图5.2：FilmArray检测仪器内部结构图。

1，芯片准备
测试芯片通过真空的方式吸入待测样品和稀释液，如下图为采用注液底座的方式向测试芯片中加入试剂的过程示意图。


图5.3：检测芯片放入仪器之前的准备过程。

首先将该测试芯片插入到注液底座中，再使用具有钝头金属套管的注射器从红色（可能为血液样品）试管中吸取一定量的试剂，插入到测试芯片的样品入口处，芯片的试剂入口处的隔膜会破裂，内部真空环境会吸取注射器内部的液体试剂，待测样品（其中含有比如鼻咽抽出液NPA或鼻咽拭子NPS的病毒转染培养液）通过样品注入口加入到芯片内部。同样的可以将稀释液注入到芯片内部。整个手工操作只需要2分钟。


图5.4：检测芯片加入血样和试剂后放入仪器中的过程。

用与仪器相连的手持扫码器扫描芯片表面的二维码，识别该芯片的种类，保质期，样品种类等等信息，然后将装载有试剂的芯片插入到FilmArray仪器中，剩下的工作就交由仪器全自动完成。

2，样品裂解
在储液管1中预装有冻干的裂殖酵母作为过程控制，样品进入储液管1后会溶解裂殖酵母。如下图所示。一旦样品进入，立即启动仪器中的挤压阀16关闭样品通道14，由于挤压阀16和36都处于关闭状态，故该细胞裂解区处于临时封闭状态。在此处，通过位于细胞裂解区对应的囊泡结构的充气和放气，可以实现挤压液体进入或流出某个腔室，混合液的快速流动和撞击会导致研磨珠研磨溶液中的细菌细胞或病毒，使得细胞破裂而释放出核酸物质。研磨完成后，打开挤压阀36，挤压24,26,28三个区域使得裂解液进入核酸纯化区。


图5.5：柔性袋中细胞裂解区内部结构及其功能


图5.5：仪器内部与细胞裂解区对应的充气囊泡结构

3，核酸纯化
如下图为专利US8409508中公开的核酸纯化区的基本结构。（也可以采用其他类似结构。）


图5.6：柔性袋中核酸纯化区的结构

从裂解液中纯化核酸和普通实验室中所用的磁珠法回收DNA的基本原理是一致的，大致可以分为核酸结合-清洗杂质-核酸洗脱的步骤：
1-核酸结合：裂解液进入核酸结合池44后，裂解液中的核酸会和预装在该池中的硅胶磁珠结合，打开挤压阀53，通过气压囊泡反复挤压核酸结合池44和磁珠回收池58，使得裂解液和磁珠在这两个池之间来回震荡混合，核酸被磁珠充分吸附，然后用仪器中的可伸缩磁铁回收磁珠。
2-清洗杂质：关闭挤压阀53,打开55.使用清洗液池中预装（也可以预装到储液管中而非清洗液池处）的乙醇,异丙醇或其他有机试剂清洗回收池58中的磁珠，此清洗过程也会在两个池之间震荡几次使得清洗充分。
3-核酸洗脱：同样，关闭阀门55，打开57，使用预装的水或其他洗脱剂来洗脱吸附在磁珠上的核酸，同样，使用囊泡结构挤压两个池使得洗脱液在两个池之间来回震荡，达到充分洗脱核酸的目的。如下为核酸纯化过程示意图。


图5.7 柔性袋中核酸纯化区进行核酸提纯的步骤说明

4，PCR-I反应及模板稀释
纯化之后的核酸则进入到第一扩增区进行逆转录或者PCR-I反应。该核酸扩增区的结构可以采用不同的形式，以下是专利US8940526中公开的一种结构形式，该结构可以同时进行PCR-I反应和扩增产物的稀释。此稀释步骤的主要作用是可以极大的消除原始宿主的模板DNA及PCR-I反应液对第二PCR的影响。如下所示。


图5.8：柔性袋中第一扩增区结构示意图

当纯化核酸进入PCR-I扩增池61后，关闭挤压阀52和72，使得该PCR-I扩增池处于暂时封闭的状态。PCR-I所需的反应试剂，包括DNA聚合酶，dNTPs，缓冲液等都可以通过储液管加入到61中，也可以通过点样预固定在61中。通过仪器上与61对应的加热板则可以进行温度的循环控制，从而实现PCR反应。
PCR-I反应完成后的扩增子需要进行稀释后才能用于PCR-II反应。此处扩增子的稀释是在挤压阀72，过渡池70，71和稀释液池62-66的共同作用下完成。该结构可以进行三步稀释法，第一步稀释：打开挤压阀72，PCR-I扩增池61中的扩增子与稀释液池62中的稀释液发生混合。稀释的倍数由扩增池61和稀释液池62的体积比来决定。第二步稀释：第一步的稀释液进入过渡池70后，与63和64中的稀释液发生混合。同理，此时的稀释倍数由过渡池70与63和64的体积比决定。同理进行第三步稀释。稀释后的模板通过通道78进入到PCR-II扩增区。

PCR-I扩增区和稀释区的结构也可以采用其他形式，比如下图中结构，


图5.9：另外一种形式的第一扩增区结构。

在稀释完成之后，需要对稀释池进行加热处理，这是PCR-II的热启动，为PCR-II做准备。

5，PCR-II反应
PCR-II的反应过程发生在热启动之后，如下图所示，该扩增区具有多个反应微池阵列，以及覆盖在微池进入通道上的挤压阀。当PCR-II反应液和模板都进入到微池后，关闭挤压阀，使得每个微池均处于封闭状态。
每个微池中通过点样预固定有PCR-II所需引物，每个微池中的引物可以相同，也可以不同，以此可以实现对不同模板上的不同区域进行扩增，从而实现多种病原菌的同时检测。大约每个PCR循环后检测微池中的荧光强度获取传统RT-PCR扩增曲线。
由于PCR-II反应后不需要将反应产物转移到其他部位，故第二扩增区的结构不需要柔性材料制备，其他刚性的塑料材质也可以。


图5.10：柔性袋中第二扩增区的一个示例结构。

6，扩增子裂解分析
在最终的PCR反应完成之后，将样品置于63度5s，然后将温度从68度升到95度，使得PCR-II获得的扩增产物发生高温裂解，每秒获取10次荧光强度信号，获取裂解曲线，即各温度下对应的每个微池中的荧光强度平均值组成的曲线。

在PCR-II过程中，也获取了RT-PCR反应中的传统扩增曲线，很多其他分子诊断仪器都是对该扩增曲线进行分析而得出检测结果。但是，FilmArray并没有使用该扩增曲线，而是采用了多级报告机制，采用了裂解曲线进行分析，第一级是单个微池，第二级是单个测试（当反应阵列中多个微池都是特定相同引物时），第三级是单个有机体。这种分析首先在过程对照实验中进行（即裂殖酵母的核酸分析），如果过程对照实验显示为阳性结果，则表示仪器操作和内部生化反应过程正常，再进行待测病原菌分析，报告其结果。如果过程对照实验显示为阴性结果，表明仪器或内部生化反应测试失败，此次测试会被认为无效且不会报告本次检测结果。


图5.11：每一个微池中固定不同的PCR-II引物后可以单独检测特定的病原菌。

对裂解曲线进行分析并得出是否感染的结果是FilmArray测试芯片相对于其他分子诊断仪器的不同之处。如下图为两个来自不同靶标的独特扩增产物的裂解曲线，以及对该裂解曲线进行负导数求解后的曲线图。


图5.12：具有不同Tm值的扩增产物其裂解曲线形状不一样。

由于PCR-II是对不同病原菌进行DNA扩增，故PCR-II扩增出来产物的长度和序列不同，该扩增产物的熔解温度Tm也会不同。在发生裂解反应时，当温度升高到扩增产物的Tm附近时，扩增产物会发生高温变性，其荧光信号也会发生急剧降低，不同Tm的扩增产物具有不同形状的裂解曲线，如上图所示，对该裂解曲线进行负导数求解分析和Tm温度分析等，将分析结果和软件中数据库的标准数据进行比对就可以很容易分辨出DNA所属的病原菌种类，进而仪器会报告对于某种病原菌是否发生感染，检测结果是“阳性”还是“阴性”。

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
该文章已经第一时间发布在微信公众号：微流控解密

----------------------------------------------------------------------------------


原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/28827258