微流控解密：Cepheid公司的GeneXpert产品

笑看风云

第一部分：公司产品简介


Cepheid公司（中文名为赛沛）于1996年3月成立于加利福尼亚州，其成立目标是解决使用常规PCR分析仪进行分子诊断过程中的各种痛点：操作过程复杂，需要专业技术人员进行操作，测试过程容易被污染，导致测试失败，检测结果容易出现“假阳性”等。
目前，Cepheid公司已经开发出了各种各样的GeneXpert分子诊断试剂盒和专门对该试剂盒进行全自动分析的测试仪器，凭借其雄厚的技术实力，Cepheid公司已经成为全球分子诊断行业的领导企业，目前GeneXpert在全球的装机量已经超过了1.1万台，在美国医院的分子诊断同类设备中，GeneXpert的装机量占比最高，接近25%。正因为该公司具有良好的发展潜力，2016年9月6日，丹纳赫公司宣布计划以40亿美元收购Cepheid公司。如下图为2010年至2014年GeneXpert仪器在全球的装机总量累计图和测试盒Xpert MTB/RIF的销售总数累计图。


图1.1 GeneXpert在全球的装机总量累计图和Xpert MTb/RIF试剂盒销售数量累计图。

Cepheid公司产品的发展目标是在任何时候对任何病人的任何样品进行任何分子方面的诊断，其GeneXpert产品也是按照这一理念进行开发的。2000年5月，该公司发布第一代产品Smart Cycler检测系统，该检测系统从开始研发之初便设立了全自动分子诊断的标准，以后开发的GeneXpert测试仪便是在此严格的开发流程和标准之下进行不断更新换代而来。


图1.2 Cepheid公司的GeneXpert检测仪器以及检测芯片。

到目前为止，GeneXpert产品已经发展成为世界上最先进的全自动分子诊断平台，它能够将样品制备，核酸扩增与检测完全整合到一个小小的检测试剂盒中，使得即使不具备专业技术的人员也可以进行复杂的分子检测，而且针对不同的疾病或病原菌，该公司已经开发出了功能齐全的试剂盒产品，满足患者从常规传染病到癌症基因检测的各个领域。


图1.3 GeneXpert分子检测试剂盒示例

GeneXpert测试芯片的优势除了结果准确，测试快速，容易使用之外，还具有：
1，集成度高：一个简单的检测试剂盒就能将样品制备，核酸扩增，定量检测等分子操作步骤都集成到芯片内部完成。
2，检测范围全面：该公司已经开发出了针对多种不同病原菌的检测试剂盒，可以检验多种环境和人体组织样品，并且样本来源可以是血液，尿液，痰液或其他来源。
3，检测过程方便快捷：根据不同的检测项目，整个检测过程可以在大约60分钟之内完成，有的项目甚至可以在30分钟内完成。并且检测得到的结果准确度高。
4，检测仪器灵活：由于GeneXpert测试仪器采用模块化设计，用户可以根据自己的检测量来选择不同仪器，从最少的单个检测到最多80个测试盒同时检测的仪器都可以选择。
5，测试过程非常安全：试剂盒是一次性使用，减少病人血样等样品的流出而导致传染，同时设备内部的安全性高，测试时试剂盒不会发生破裂而污染周围环境。


图1.4 GeneXpert测试仪器检测病原菌的优点

目前GeneXpert已经上市的试剂盒产品超过30种，可进行如下检测：B族链球菌，肠病毒，白血病，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，耐药性结核分枝杆菌，慢性粒细胞性白血病融合基因，丙肝病毒，乳腺癌，黑色素瘤，炭疽热，瘟疫，野兔病等项目，如下图将目前GeneXpert试剂盒的检测项目划分为四个部分，分别为：健康关联检测，急性传染病检测，生殖健康检测，肿瘤/遗传病检测。


图1.5 GeneXpert测试试剂盒种类及简介

1，GeneXpert检测仪器介绍

GeneXpert检测系统采用独立的i-CORE单个模块设计，可以在检测仪器中添加或减少检测模块，从而组装成多个试剂盒同时进行检测的仪器，提高检测通量，减少检测时间，特别是在人口众多，检测量大的地区，该模块化设计的优点就更加突出。


图1.6 GeneXpert测试仪器的发展历程

从图中可以看出，在早期的GeneXpert测试仪器中就采用了独立的I-CORE单个模块的设计理念，基于该理念的单个测试模块—GeneXpert Module就是单个芯片测试所必须的组件的集成。随着公司技术的发展，Cepheid在此Module的基础上不断将多个Module集成到一个仪器中，组建了可以同时测量多个芯片的系统，如GX-I，GX-II，GX-IV，以及可以同时进行48或80个测试的平台，如GeneXpert Infinity测试平台。
GeneXpert Infinity测试平台可以认为是目前最具有自动化，最完整的分子诊断系统，目前可以同时进行48或80个试剂盒的测试。理论上，在24小时内，Infinity-48测试系统最多可以进行1300个测试，而Infinity-80测试系统最多可以进行2300个测试。


图1.7可同时进行48个（左）和80个试剂盒（右）测试的全自动测试仪。

下图为各种型号的GeneXpert测试仪器的三围尺寸。


图1.8各种型号的GeneXpert测试仪器的尺寸

如下图为将8个测试试剂盒同时放入到GX-XVI测试仪器中的样子。


图1.9将8个试剂盒同时放入到GX-XVI测试仪器中

2，健康关联检测试剂盒

在Cepheid公司的官网上已经公布的健康关联检测试剂盒有9种，包括艰难梭菌C.difficile，艰难梭菌/流行性027菌株等，以下是部分检测试剂盒的截图，可以看出大部分试剂盒的检测时间都是在45min到60min.


图1.10 部分健康关联检测试剂盒

下面以测试艰难梭菌C.difficile的试剂盒来简单介绍，目前分子诊断测试方法都要求检测人员在检测速度和准确度上选择，市面上缺少一种既能保证检测准确度，又能够进行快速检测的试剂盒，而GeneXpert的艰难梭菌试剂盒就是这样一种不需要牺牲检测准确度，同时又能够快速检测的产品，在45min之内，该试剂盒具有非常高的准确度，不需要额外的或重复的检测，而且试剂盒内部的控制方法可以保证检测结果的准确性。

3，急性传染病检测试剂盒

Cepheid公司目前已经公布的已经面市的急性传染病检测试剂盒有6种，包括一些常见的流感类，MTB/RIF，EV病毒的检测，其中以MTB/RIF试剂盒的销售量最大，而且该试剂盒发展比较早，市场占有率非常高。


图1.11 部分急性传染病类检测试剂盒

在众多检测试剂盒中，MTB/RIF试剂盒可以认为是该公司最成功的键盘，该产品主要检测耐药性结核分枝杆菌。在该产品出现之前的大约100多年里，诊断结合分枝杆菌的普遍方法是使用痰涂片镜检法，但是该方法敏感度差，漏检率高达40%，而且检测过程复杂，耗时太长，难以满足快速诊断的需求，而MTB/RIF检测试剂盒是Cepheid公司和新泽西医学与牙科大会共同合作完成，该产品的成功面市可谓是Cepheid公司的经典之作。

4，生殖健康检测试剂盒

目前Cepheid公司公开的生殖健康类检测试剂盒有四种：阴道滴虫TV检测试剂盒，沙眼衣原体/淋病奈瑟式菌CT/NG检测，分娩筛查GBS，产前筛查GBS LB试剂盒，看来Cepheid公司的产品不仅仅针对病原菌的检测，还可以对孕妇或胎儿进行筛查。如下图为这四种甚至健康类检测试剂盒。


图1.12 部分生殖健康检测试剂盒

传统的生殖健康检测方法，比如培养皿检测方法，要耗费将近72小时，而其他的核酸检测方法最少也需要将近1个小时，而GeneXpert的检测试剂盒只需要将近35-55分钟的时间，便可以得出准确的结果。


图1.13 GeneXpert GBS LB检测试剂盒相对于其他方法的优势

5，肿瘤/遗传检测试剂盒

截至目前，Cepheid公司网站上只公布了一种肿瘤/遗传检测试剂盒—血栓遗传风险检测试剂盒，该试剂盒可以在30分钟内检测出患有血栓的几率。


图1.14检测血栓风险的遗传检测试剂盒

以下公布几张GeneXpert测试试剂盒的照片，如下是从侧面观察到的测试试剂盒，后面突出的部分是PCR反应管。


图1.15 GeneXpert测试试剂盒的侧面和后面照片


图1.16 将单个测试试剂盒放入到GeneXpert测试仪器中

6，Cepheid摩托车

Cepheid公司不仅具有高超的分子检测技术，还有优秀的营销策略，下图是该公司开发的Cepheid摩托车，将速度和激情和试剂盒完美的结合在一起。




图1.17 Cepheid公司的GeneXpert摩托车，够酷吧。。。

7，未来将要上市的检测试剂盒

Cepheid公司开公布了最近几年将要上市的检测试剂盒，如下图所示，目前在全世界范围内大约有32种试剂盒，但是在2018年将会有35种测试试剂盒面市，让我们拭目以待吧。。。


图1.18 Cepheid公司的产品路线图

第二部分：仪器和芯片内部结构剖析


和其他POCT产品一样，GeneXpert产品也是由两部分组成：仪器和芯片。
为了便于看官们对GeneXpert微流控芯片的运作机理有更深的理解，也便于各位更明确的了解芯片内部结构，焜哥打算在对芯片内部结构进行剖析之前，简单介绍一下仪器内部的基本结构，特别是和芯片检测有关部分的结构。

1，GeneXpert仪器内部结构剖析

根据Cepheid公司公开的资料，GeneXpert测试仪器是由I-CORE模块（Intelligent Cooling/Heating Optical Reaction Module）衍变而来，最初的衍变形态是Smart Cycler检测系统，该系统是Cepheid公司发布的第一代产品，于2000年5月面市。如下图所示，再后来的发展中，公司瞄准了多模块，多检测同时进行的路线，希望通过模块的集成来实现多个不同测试盒的同时检测。故而基于I-CORE模块发展出了针对单个测试盒的GX模块，这个模块可以被认为是GeneXpert仪器的前身。


图2.1 GeneXpert测试仪器是由I-CORE模块衍变而来

目前的GeneXpert检测系统，不管是能够进行单个测试盒检测的GX-I，还是可以同时进行48个测试盒检测的GeneXpert Infinity-48系统都是在单个GeneXpert模块上进行系统集成而来。下面这张图实在太经典，也展示了Cepheid公司产品的发展路程，焜哥打算再用一次。


图2.2 GeneXpert测试仪器的发展历程

所以就Cehpeid产品来看，虽然其产品功能越来越复杂，能够检测的测试盒也越来越多，但万变不离其宗，其内部最重要的部件仍然是I-CORE模块及其发展出来的GeneXpert模块。
下面只对这两个模块进行深入探讨。下图展示了I-CORE模块的一些组成部分及其功能。


图2.3 I-CORE模块内部结构图

I-CORE模块内部主要的几个组成部分为：
热板：当PCR反应管插入到I-CORE内部的加热模块中时，用于对PCR反应管的上下两侧进行升温以进行PCR循环反应。
激发光组件：产生激发光，透过PCR反应管内部，促使内部的荧光发生激发。
光检测组件：检测PCR反应管内部的荧光信号，实时测算PCR的循环状态。
风扇组件：用于向PCR反应管吹风降温。
这几个主要的部分如下图所示。


图2.4专利US9322052中公开的I-CORE模块结构示意图

下图更详细地说明了I-CORE内部结构及各结构的功能，并且在专利US9322052中也详细介绍了该模块的运作方式。


图2.5 I-CORE模块的电子区块图

为了完成PCR反应的检测，I-CORE模块中集成了6个通道的光路（虽然上面几个图仅仅展示了4个通路，但实际上有6个光路）。下表展示了6个通路中各个激发光波长和发射光波长，以及对应的检测目标染料。


图2.6 I-Core组件中各检测通道的激发光和发射光波长

GeneXpert模块从外部整体来看，包括有几个重要部分：
活塞杆柄驱动电机（Syringe Motor）：用于控制内部活塞杆柄的向上或向下运动，从而实现给测试盒内部压入试剂或抽取试剂的作用。
I-CORE模块：该GeneXpert模块的核心。上面已经讲述过其结构和作用。
测试盒放置部位（Cartridge Inserter）：可以打开和关闭，使得用户将测试盒放入。
阀门驱动电机（Valve Drive Motor）：驱动阀门驱动部位的旋转，进而带动测试盒底座的旋转。
超声探头（Ultrasonic Horn）：发出超声并传导到测试盒底座处，用于细胞裂解。


图2.7 GeneXpert模块结构图

下图展示了GeneXpert模块中测试盒放置部位（Cartridge
Inserter）的结构，从上到下分别是：
活塞杆柄：其功能是插入到测试盒顶部的开口中，推拉测试盒中心柱内部的活塞，实现测试盒内部液体的转移和混合等；
I-CORE反应管插入部位：测试盒上的PCR反应管插入到该部位，对应于图2.3中I-CORE模块内部结构中的Heater部位。此处具有加热模块和光学探测模块。
阀门驱动部位：测试盒放置于该部位，旋转该阀门驱动部位即可旋转测试盒的底座，从而使得测试盒中的开口对应于不同试剂池，构成试剂通路。
超声探头：位于该底座中心，对应于测试盒的正下方，其功能是发出超声使得测试盒中截留的细菌等病原菌发生裂解，从而释放其核酸物质。
（关于这部分的运作机制和具体功能还需要参考第四部分：芯片的检测流程）


图2.8 GeneXpert模块中芯片放置部位的结构说明

2，微流控芯片内部结构剖析

GeneXpert微流控芯片（以下也成为测试盒，检测试剂盒等。）根据结构上的紧凑度可以划分为四个部分：盖子，试剂池，底座，反应管。
如下图右边展示了测试芯片的主要结构，可以看出最上面的蓝色盖子，中间透明的白色塑料构成的试剂池，下部阀门旋转体和蓝色支撑构成的底座，在侧面上突起的反应管。


图2.9 GeneXpert测试模块（左）和测试芯片（右）主要结构图

2.1盖子

盖子结构简单，主要包含有两部分：上层的顶盖和下层的底盖，两层盖子通过铰链连接，可以打开或关闭。如下图为专利US9394086中公开的一种盖子结构示意图。在顶盖上有一个大的主开口（有的测试盒没有主开口，但是中心位置必定有一个圆形开口，用于仪器中活塞杆柄的插入），和下方的突起120对应，底盖上有很多圆形通孔，这些圆形通孔都是围绕一个中心柱143来排列，每个圆形通孔都和下方试剂盒中某一个试剂池相对应，用于向这些试剂池中添加液体试剂。由于测试盒的种类不同，所需要的液体试剂数目也不同，故而底盖上圆形通孔数目也不同。突起上还有气孔，用于试剂池中液体运动时气体排出。


图2.10 一种盖子结构示意图

2.2试剂池

测试盒的主体部分是白色塑料构成的试剂池，该试剂池中预装有液体试剂或固体试剂球，均是参与生物反应所必须的，比如：细胞裂解液，DNA清洗液，PCR主反应液，废液等。如下图所示。


图2.11 测试盒外观结构和顶视图。

GeneXpert测试芯片基本上有两种，A型芯片和C型芯片，但是这两种芯片的内部结构基本一致，唯一的区别在于底座结构。如下图为A型芯片中试剂池的腔室结构图，整个芯片有11个腔室结构，较小数字表示的腔室用于样品处理，如细胞裂解，核酸提取，核酸纯化等，较大数字表示的腔室用于后续PCR或反转录PCR反应。


图2.12 A型芯片内部的腔室结构图。

下图展示了试剂池中存储的试剂有几种并非是常规的液体状态，而是包含有各反应成分的冻干状态的试剂球，使用试剂球而不是常规液体的优势在于可以长期保存，从而提高测试盒的保质期。液体状态的试剂在长期保存时会挥发使得试剂量减少从而影响后续反应，固体试剂球便于长期保存，且在使用时只需要用缓冲液溶解即可使用。
如下图为试剂池中填充了固体状试剂球的示意图，在每一个预装有试剂球的试剂池上部分均有一个较大保持球（Retaining ball），其作用是阻拦下方的试剂球由于浮力作用上升到液体表面而不能完全溶解。试剂球有好几种，比如有专门用于过程控制的控制样本球，酶反应试剂球（其内部包括有Taq聚合酶，dNTPs，BSA等），目标特异性试剂球（其包括引物，内部控制试剂等）。


图2.13 试剂池中预装有反应试剂球的结构示意图

专利US9057674中公开了使用固体试剂球来保存试剂成分的装置，如下图所示，在测试盒保存时，保持球和试剂球均在试剂池的底部，但保持球仍在试剂球的上部。一旦测试盒放入GeneXpert仪器中开始进行测试时，溶解液会进入到试剂池中，保持球和试剂球会在浮力作用下上升到溶解液上部分，但是由于保持球的尺寸控制的比试剂池内径稍小，试剂球不会通过该缝隙而上升到液面上。通过一段时间的溶解，或者通过混合，加热等其他外力来加速溶解，试剂球会完全溶解在液体中，通过加压或普通重力作用，液体会通过试剂池下方的液体出入口而进入到底座中，进行下一部反应。


图2.14 试剂池中试剂球溶解过程示意图

2.3 底座

试剂池只是该测试芯片的试剂预存部位，但整个测试芯片中的流体处理过程和核酸提取过程都是在底座上来完成，可以认为底座是个设计非常巧妙的反应试管。如下图中不仅可以清楚的看到测试盒的四个基本结构，还能够看出底座的组成部分。


图2.15 测试盒内部结构剖析

在专利US9669409中公开的一种测试芯片结构中详细描述了该底座的结构和功能，如下图所示。该底座除了基本的支撑结构之外，还有几个特别重要的地方，需要单独讲述一下：
1，中心柱：其内部有活塞，便于仪器中活塞杆柄插入到测试盒内进行挤压和抽提该活塞，从而实现液体的提取和挤入。
2，旋转控制阀：可以旋转使得圆盘上的第一外口和第二外口对应于试剂池下方的通孔，或根据需要两个外口均关闭不与试剂池相通。
3，第一外口和第二外口：旋转圆盘后外口会与上方试剂池相通，从而在活塞挤压下试剂池中的试剂从外口中进入过滤膜处，剩余液体被导入废液池。
4，过滤膜：孔径非常小，用于截留样本中的细菌病毒等病原菌，并且在超声探头的作用下，此处的病原菌发生细胞裂解释放核酸物质。


图2.16 专利US9669409中公开的一种测试芯片底座结构图（正视图）


图2.17 专利US9669409中公开的一种测试芯片底座结构图（底朝上）

下图是底座横截面图，可以看出其内部结构。关于这个底座如何实现流体驱动，并完成核酸提取，分离纯化等生化步骤，请参考第四部分：芯片的检测流程。


图2.18 专利US9669409中公开的一种测试芯片底座结构剖面图。

2.4反应管

测试盒中的反应管实际上就是PCR反应池，因为该反应管是专门用于进行DNA的PCR扩增反应的，由于PCR反应需要不断的进行升温-降温操作，故与测试盒相对应的仪器内部需要有快速升温降温的温度控制模块，为了便于该反应管与温度控制模块充分接触，GeneXpert的测试盒中反应管设计成一个突出来的三角形结构，在测试时，该三角形结构插入到测试仪器的凹槽中，便于温度控制和反应过程中扩增产物的实时光学检测。关于仪器中与反应管对应的结构，请参考本部分的I-CORE模块内部结构和功能。
下图是专利US9322052中公开的PCR反应管结构图，可以看出各部分的具体结构，其中比较重要的部位是反应室42，该处是PCR反应发生场所，当热板紧贴该处的密封膜上后，就可以对该处进行精确的温度循环控制，促使内部发生PCR反应，在侧面上，通过LED引入激发光，反应试剂中的荧光会在激发光下发出发射光，从而被另一侧的LED所接收，从而得出RT-PCR的扩增曲线。


图2.19 反应管的一种结构图

反应管设计成薄的塑料层的形式是为了提高比表面积，以更好的进行热传导，更快的升温和降温。反应管的上面和下面是由两层柔性薄膜密封，在PCR反应时，热板会直接和该柔性薄膜接触，从而传导热量给反应管中的反应室，故而该柔性薄膜的厚度要尽量薄便于热量传递，比如此处该薄膜厚度为0.025-0.08mm.
虽然理论上该反应管可以采用多种聚合物材料制备，比如PP，PE，PDMS等，但是在实际上使用PP材料最多，因为PP材料不会对PCR反应产生抑制作用。在Cepheid公司的其他专利如US9316590中也介绍了反应管和I-CORE模块的其他实施例，其大体结构和功能与上面介绍的类似，在此焜哥就不深入探讨了。
讲述了这么多内部结构，焜哥都快忘了GeneXpert测试盒的外观结构了，还是来一张震撼的外观图让我们的大脑回归到正常状态吧。。。


图2.20 GeneXpert测试盒外观图

第三部分：芯片的封装方法


虽然GeneXpert测试盒内部结构复杂，功能模块多样，但焜哥相信再复杂的产品也是由一个一个的零件搭建起来的，本部分主要讲述如何将各种零部件搭建成功能完善的测试盒。
根据焜哥对GeneXpert测试盒的剖析（请参考第二部分：仪器和芯片内部结构剖析），焜哥认为该测试盒可以简单分为四部分：盖子，试剂池，底座，反应管，但是封装的过程很有可能不是简单的从上到下的方式，故焜哥根据封装的过程依次介绍。

3.1底座的封装
测试盒的底座很有可能是最先装配完成的部件。底座并不是一个或几个简单的零部件组成的，而是由多个小零件相互配合组装而成，如下图为底座结构的爆炸图，可以看出从上到下的多个主要零件。这一部分的零部件虽然都是塑料材质，但学过机械的朋友们是不是发现该部件长得特别像金属机械零部件？该零部件之间也可以通过胶粘，热贴合，紫外固化，超声焊接等方式组合在一起，进而成为底座整体。
当然对于底座的封装流程，以及后续其他部位的封装贴合等，焜哥个人认为依据美帝的技术，很有可能是由工业机器人来实现自动封装，所需要的人为干扰特别少，便于连续生产和过程控制。对于工业机器人封装该塑料底座的场景，各位可以去看看特斯拉的全自动生产工厂，脑补一下机器手臂封装测试盒的过程。


图3.1 底座各个结构剖析。

3.2试剂池的封装
焜哥相信，和上面底座的零部件的制备方法一样，试剂池的制备也是通过注塑成型的方式来完成的，毕竟只要材质确定，用Pro/E或SolidWorks等软件画出三维结构图，然后交由注塑厂商来开模-浇筑-成型，制备出该试剂池外壳并不是难事。在生产工艺上，除非通道尺寸非常小，一般的生产厂商都能够轻松实现。
同样，注塑完成之后的试剂池盒子可以通过胶粘，热贴合，紫外固化，超声焊接等方式来固定在下方的底座上，这一部分由于技术含量比较低，且大部分和上面底座的封装方法大同小异，故焜哥不在深入探讨。

3.3盖子的封装
盖子的制造主要是通过注塑成型的方式完成，毕竟注塑成型的方式成本低，可大规模制备，产品重复性高等，所以在芯片的制备上，很多公司会优选选择注塑成型方法。该盖子结构并不是一个模具浇筑而成的，很可能由一个模具浇筑顶盖，另一个模具浇筑底盖，然后将顶盖和底盖通过铰链连接在一起来制备的。专利US9394086中不仅公开了盖子结构，还公开了将盖子结构通过超声焊接到下方试剂池上的方法，感兴趣的朋友们可以自行翻阅该专利了解更详细的技术点。如下图所示。


图3.2 盖子是通过超声焊接的方式连接到下方的试剂池上。

3.4反应管的封装
反应管从结构上来讲比较简单，只是简单的PP材料做成的塑料片，有两层薄膜密封而成，如下图是专利US9322052中公开的PCR反应管的封装过程。总体上来讲，反应管可以先通过注塑成型的方式制备中间的主体部分，在通过胶粘或超声焊接的方式将密封膜贴付到主体表面上。


图3.3 反应管的结构和封装方法

在反应管制备完成之后需要将反应管连接到试剂池上，组成一个完整的测试系统，专利US9322052中公开的这种反应管结构上有两个定位栓，可以辅助反应管正确连接到试剂池上。在其他的图片中，焜哥注意到有的反应管并不是采用定位栓直接插入试剂池的方式，而是采用如下图的方式直接平滑推入的方式安装的。


图3.4 反应管采用平滑推入凹槽的方式固定在测试盒体上。

3.5试剂的装载
一个成熟的产品不仅需要结构完整，还需要功能完善。该测试盒在各个部分都封装完成之后，还需要向试剂池中加入预装试剂才能保证测试流程的顺利进行。
对于液体试剂的装载，操作过程则比较简单，可以通过注入机利用气压自动吸取定量的试剂，装填到测试盒中特定的试剂池里。
但是对于固体状态的试剂球，其装填方式就要复杂一些，因为要保证每个测试盒中都装填定量的个数，且由于各试剂池相距不远，人工操作的话可能引入操作错误，而且难以检查，生产过程中质控比较难，所以Cepheid公司专门研究了一种试剂球的装填设备，公开在专利US9446409中，下图该专利公开的一种试剂球装载装置，试剂球预先被冻干，并密封在条带中的球仓中，每个试剂球的大小均相等，以此保证溶解后溶液的物质浓度一致。将预装有试剂球的条带放入装载装置的条带通道中，并连接到出口处的滚轴上，有滚轴带动条带运转，同时盖子条带连接到计数器上，盖子条带从条带上撕裂后释放预装的试剂球进入到下方的待装载的测试盒中。通过这种工业化装载装置可以实现全自动的试剂球装填，且极大的减少了人为装填的位置错误，个数错误等。


图3.5专利US9446409中公开的一种全自动试剂球装载装置。

下图是网上公开的一个GeneXpert测试盒封装生产线的一部分，虽然难以看清其全部的封装流程，但能在此处管中窥豹，也可见一斑了。


图3.6网上公开的GeneXpert测试盒封装流程的一部分。

通过上面的五个封装步骤，GeneXpert测试盒才算是基本完成，当然还需要将完成后的芯片装入塑料袋，加上其他的试剂瓶，塑料管等辅助材料，最终都装入一个大的试剂盒中，如下图所示为消费者最终拿到的试剂盒的样子，是不是和常规的生化试剂的试剂盒外观上很相似。


图3.7 GeneXpert封装完成之后的外观。

第四部分：芯片的检测流程


和其他成功的微流控芯片一样，GeneXpert芯片的一个突出的优点在于，芯片检测前处理非常简单，这就不需要专业的实验技能人员来操作也能很好的完成测试。在检测前处理工作完成之后，把芯片放入仪器后就可以走开去喝咖啡了，等品尝完咖啡回来，检测结果就出来了。下图简单讲述了MTB/RIF测试盒是如何完成样品的前处理，芯片放入测试仪器后主要完成的步骤。


图4.1 GeneXpert测试盒MTB/RIF芯片的主要测试步骤。

所以本部分打算分步骤地讲述芯片内部的各步生物反应过程，以此更好的讲解整个芯片的检测流程，让看官们更好的了解芯片是如何工作来实现从“样本”到“结果”的测试需求的。下图是简化的GeneXpert测试盒的检测流程图，也是仪器内部主要的测试工作。


图4.2 GeneXpert测试盒常规检测步骤。

4.1 芯片手工准备工作
GeneXpert测试盒手工准备操作简单，耗时少，一般情况下整个手工操作时间约为2min，如下图为在使用MTB/RIF测试盒时，手工处理痰液样本的流程图。


图4.3 GeneXpert测试盒常规检测步骤。

大体上来说，由于痰液有直接获取的液体状和依附在固体载体上的痰液，两者的前处理方式也是不一样的，液体状的痰液其前处理过程简单一下，此处不再讲述，而对固体载体上的痰液沉淀物，其处理实验过程可以参考下图，针对MTB/RIF测试盒的手工处理痰液沉淀物的实验步骤，对具体实验步骤感兴趣的童孩可以好好研究一下：


图4.4 GeneXpert测试盒常规检测步骤。

对于其他项目的测试盒，其手工准备步骤大体相同，只是一些细节方面有些差别，比如下图为另外一种GeneXpert测试盒的测试前准备工作，焜哥根据经验，推断该测试盒很有可能是用于检测急性传染病，特别是呼吸道感染病菌检测试剂盒，比如流感类，EV病毒检测测试盒。


图4.5 GeneXpert急性传染病诊断测试盒手工准备过程。

4.2 样品裂解
一旦将手工准备完成的测试盒放入到GeneXpert测试仪器中后，测试盒就会自动进行各种测试，在仪器内部，该测试主要完成的步骤为下图所示，简单的可以分为样品裂解—核酸纯化—PCR扩增—光信号读出结果。


图4.6 GeneXpert测试仪器中完成的检测基本步骤。

在Cepheid公司的专利US9669109，US9212980，US8673238中已经公开了使用该测试盒进行样品裂解的方法，即首先通过抽提活塞的方式将样本从测试盒的样本试剂池吸入到底座中的流体处理区，在该流体处理区内已经预装有多层过滤膜，可以对样本中的细菌，病毒等感兴趣的病原菌进行过滤。由于过滤膜的孔径大小非常小，比如0.22um或更小，感兴趣病原菌都被截留在该过滤膜上，通过清洗液的清洗，此处会将其他干扰物质清洗干净。然后启动仪器中测试盒底部的超声探头，利用超声来破碎过滤膜上截留的病原菌，当然，超声强度和时间完全可以通过仪器的程序来控制。以下是测试盒内部一系列流体运作图，来实现病原菌的截留和超声探头的细胞破碎。














图4.7 测试盒内部流体运作步骤以实现样本裂解功能。

4.3 核酸纯化
感兴趣的病原菌在过滤膜处发生细胞裂解后，细胞内部的各种细胞器都会释放出来，细胞膜碎片，有些病菌的细胞壁等也会有些残留在过滤膜处，故可以通过类似的活塞抽提-压入方式导入清洗液来回反复的清洗，达到核酸纯化的步骤。由于专利中并未对核酸的纯化步骤进行详细介绍，焜哥也不便自作妄论，但焜哥相信，过滤膜并非单一的结构简单的一层膜（可以参考专利US9322052），可能是由不同结构，具有不同过滤性的多层膜重叠而成，所以里面可能具有对核酸有特异性吸附的硅胶颗粒或硅胶膜等结构，结合清洗液的反复清洗，完全可以去除掉裂解液中的细胞器，细胞膜或细胞壁等杂质。

4.4 RT-PCR扩增反应
在核酸纯化之后，通过活塞的抽提吸入可以将试剂池中的PCR反应试剂，该试剂包括有dNTPs，DNA聚合酶等，当然，根据第二部分-仪器和芯片内部结构剖析的介绍，此处的试剂并非简单的液体试剂，而是固态的试剂球的形式，此时通过引入稀释液到反应试剂球所在的试剂池中，可以完全将PCR试剂球进行溶解，在将溶解液转移到核酸所在的过滤膜处，将核酸洗脱到溶解液中进行混合，为PCR反应做准备。
当然，整个PCR反应和对应的光学结果检测实在测试盒上的反应管内完成的，该反应管插入到仪器中的温度控制模块内，通过仪器精确控制温度的升温和降温，来进行PCR扩增反应。由于仪器内部具有六个不同的光学通路，故每个PCR扩增完成之后均可以通过光线来检测扩增产物的浓度，绘制出RT-PCR扩增曲线。GeneXpert对病原菌的感染与否都是通过对该扩增曲线的解读来完成的。
如下图是PCR反应试剂和DNA被转移到反应管中的过程示意图，请注意反应管和测试盒的连接处的设计非常巧妙，既能保证试剂池中的试剂不会发生液体泄漏，也能保证将PCR反应试剂填充到反应管的反应池中。有过实际的液体转移操作经验的童孩还应该会想到，此步骤很容易引入一些气泡，干扰后续PCR的反应，但此处反应管的结构设计上却能避免气泡的产生或有助于气泡的排出，感兴趣的童孩可以研究一下此处的结构。










图4.8 测试盒内部流体运作步骤以实现PCR反应液的转移。

4.5结果解析
GeneXpert采用了多重PCR，快速RT-PCR技术，一系列类似芯片可以进行多种样本的多个位点测试。GeneXpert测试盒的结果解读也是由其专用的软件系统来完成，可以说，整个仪器的测试流程也完全是由软件来控制的，特别是对可以同时进行48个测试或80个测试的Infinity系统来说，每一个测试的进度，测试种类都是有软件控制，故而每个测试都可以中途暂停或中途加入其它测试等。下图是其软件系统的一个界面，可以看出使用MTB/RIF进行测试时的扩增曲线。


图4.9 GeneXpert测试软件中的扩增曲线界面。

需要注意的是，GeneXpert整个测试流程是有其内部的控制系统的，防止在检测时出现各种意想不到的错误，比如在测试前需要考察测试盒内部探针是否被破坏，测试时是否发生了正确的核酸提取过程，核酸是否按照预期发生了正确的PCR反应等，都需要判断并排除，只有在各种控制系统都没有问题的情况下才能报告检测结果，这样可以保证测试的结果可靠性和测试的稳定性，减少假阳性的发生概率。
GeneXpert测试盒内部采用了两种错误检测机制，即探针检测和SPC内部控制（Sample Processing Control，样本处理控制），测试盒不需要单独的外部阳性或阴性对照。采用外部对照的方式难以保证测试的性能。
探针检测进行自检的原理是：在PCR热循环启动之前读取不同温度下的多个荧光信号，这些信号结果和存储在机器内部的标准结果进行比对。如果结果符合，则说明该测试芯片没有错误，可以进行热循环反应，如果出错，则直接退出并报错。探针检测机制可以检查：微珠的溶解，PCR管填充，探针的整合度，染料或淬灭剂的不稳定性等处是否发生错误。如下图介绍了采用探针检测可以排除的几个可能出错点。


图4.10 测试盒内部的探针检测报错机制说明。

样品处理控制（SPC控制）是指：芯片内部具有完好无损的有机体，或DNA或RNA，或检测探针，引物等，该有机体与目标病原菌一样进行整个样品处理过程，其内部的DNA或RNA也和目标DNA一样进行PCR扩增反应，从反应结果上就能看出待测样品处理过程是否正确，PCR反应管是否完全发生反应，也能检测体系中酶或其他成分的降解情况，还能检测样品的反应抑制情况。如下图解释了测试盒内部的SPC检错机制。


图4.11 测试盒内部的SPC检错机制说明。

常规RT-PCR测试使用三种方式进行自检：DNA阳性对照用于检测试剂的完整度，DNA阴性对照用于检测环境或试剂是否受到污染，内部控制用于检测PCR抑制情况验证试剂的完整度。而GeneXpert的RT-PCR反应仅仅采用两种方式进行自检：DNA阳性对照用于探针检测，SPC内部控制不仅用于扩增自检还可以用以DNA提取过程检测。
其SPC内部控制的判断依据是：在待测样品为阴性时，SPC必定为阳性；但待测样品为阳性时，SPC可以为阳性也可以为阴性。请各位看官自行思考这里面的逻辑。
下图是测试盒内部检错机制和结果报告流程，可以看出对于结果的报告并不仅仅依赖于RT-PCR扩增反应结果，还需要看SPC的反应结果。


图4.12 测试结果为阳性时不需要考虑SPC结果直接报告为“阳性”，但测试结果为阴性时则必须要确认SPC为阳性才能报告为“阴性”。

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