CCK-8实验结果异常？一文告诉你见招拆招

生物科研实验室

一、重复孔差异显著

除了操作误差的影响，以下要素也可能导至重复孔差异显著：

01 接种不均

①细胞悬液混合不充分：在接种前，若细胞悬液未充分混合，或混合过程中存在细胞沉淀，就容易造成接种时细胞分布不均，最终可能导至不同孔差异较大。

②接种手法不恰当：接种时，若加样速率过快、加样量不准确等，都可能导至细胞在孔板中的分布不均。

③细胞生长状态不一：若细胞在接种前生长状态欠佳，如细胞衰老、凋亡等，或细胞间存在生长差异，也可能导至接种后细胞分布不均。

改进方法

①保证细胞悬液混合均匀：在接种前，可采用多次吹吸、轻柔震荡等方法来确保细胞悬液的均匀性，避免细胞沉淀。

②优化接种技巧：可使用移液器或合适的加样工具，斜贴孔板壁加样，以减少平行孔间的误差。注意控制加样速率和加样量，确保每个孔的细胞数目一致。

③评估细胞生长状况：在接种前，使用倒置显微镜等工具对细胞进行显微镜检查，观察细胞形态和生长状况。确保使用新鲜、健康的细胞进行试验，避免使用衰老或凋亡的细胞。

02 暴力加药

暴力加药可能会使细胞遭受机械性损伤，影响细胞的生长和增生能力，导至不同孔之间存活细胞数量有差异，最终可能引起重复孔OD数值差异。

改进办法

温和加药：在加药过程中，应尽量避免粗暴操作。应使用合适的移液器等工具，将药物缓慢、均匀地加入孔板中。同时，要注意控制加药速率和加药量，避免产生气泡和药物溅出。

03 液体挥发

在96孔板等微孔板中，边缘孔由于更易受到外界环境的影响（如温度变动、空气流动等），其挥发速率通常比内部孔更快。这会导至边缘孔内的细胞生长环境与其他孔存在显著差异，从而产生所谓的“边缘效应”，影响试验结果的均匀性和可靠性。

改进方法

①预先加入培养基或缓冲液：在接种细胞前，可先在孔板的最外侧两排加入适量的培养基或缓冲液（如PBS），以减少内侧孔的液体挥发。同时，由于细胞培养箱的内部结构、风道设计等布局的影响，不同位置的温度可能有差异，建议将孔板置于培养箱中央位置。

②缩短培养时间：根据试验的具体需求和细胞生长特性，尽量缩短细胞在孔板中的培养时间，以减少液体挥发的累积效应。

04 检测前未混合均匀

CCK8试剂与细胞共同孵育后，会生成橙黄色的甲臢产物，其颜色深浅与细胞数量及活性呈正比。若检测前未将孔内液体充分混合均匀，可能导至不同区域的甲臢产物浓度不一致，从而在测定OD数值时产生偏差。

改进方法

充分混合孔内液体：在加入CCK8试剂并孵育一定时间后，轻轻摇动或敲击孔板，使孔内液体充分混合均匀。注意避免产生气泡，因为气泡会影响OD数值的测定。若孔内液体体积较大或细胞密度较高，可以考虑使用移液器轻轻吹打孔内液体，以进一步促进混合均匀。但需注意操作要轻柔，避免对细胞造成损伤。

二、组间差异微小

不同组之间差异微小，可能存在以下一些原因：

01 细胞接种密度过高

当细胞接种密度过高时，基于细胞膜上糖蛋白的识别作用以及细胞间的相互作用，细胞会出现“接触抑制”，可能使得不同处理组之间的差异变得不明显。

改进方法

①优化细胞接种密度：通过预试验确定最佳的细胞接种密度。一般来说，应确保细胞在培养过程中既不过于稀疏也不过于密集。这样可以使细胞在培养过程中保持良好的生长状态，同时减少因密度过高或过低而导至的误差。

②改善细胞培养条件：确保细胞在培养过程中获得充足的氧气、营养物质和生长空间。这可以通过定期更换新鲜培养基、使用透气性好的培养板和调整培养条件来实现。

02 药物的作用

①药物的氧化还原特性的影响：某些药物具有还原性（如维生素C），这些药物可能会与CCK-8发生显色反应，从而增加吸光率，导至测量结果偏高，进而掩盖了不同组间的真实差异。

另外，药物中的金属离子（如氯化亚铅、氧化铁、硫酸铜等）也可能对CCK-8的显色反应产生抑制作用，降低检测灵敏度，从而使得不同组之间的差异不明显。

②药物对细胞的直接影响：药物可能直接影响细胞的生长、增生或代谢，但是由于药物浓度、作用时间等因素未达到显著差异的阈值，这种影响在不同组之间差异较小。

③药物颜色的影响：药物本身的颜色可能与CCK-8反应后生成的橙黄色甲臢产物颜色相近或产生叠加效应，从而干扰了吸光率的准确测定。另外，pH变化会导至溶液中的酚红变色，影响OD数值的检测。这些干扰可能使得不同组的差异较小。

改进方法

①药物预处理：在加入CCK-8之前，更换新鲜培养基以去除药物对CCK-8测定可能产生的影响。特别是当药物具有氧化还原特性时，这一步骤尤为重要。

②优化药物浓度和作用时间：根据药物的特性（如IC50值）和试验目的，选择合适的药物浓度和作用时间进行试验。可以通过预试验来确定最佳的药物浓度和作用时间范围。

③设定合适的对照：通过比较试验孔、阴性对照孔与空白对照孔的吸光率差异，可以更准确地评估药物对细胞的影响。

03 孵育时间过长

CCK-8试剂与存活细胞中的脱氢酶发生反应，生成橙黄色的甲臢产物；随着孵育时间的延长，甲臢产物的积累量逐渐增加，颜色逐渐加深，检测的OD数值也因此上升。然而，当颜色达到一定程度后，可能会达到饱和状态，此时即使细胞活性存在差异，OD数值的变化也不明显，从而导至组间差异减小。

改进方法

优化孵育时间：通过预试验确定最佳的孵育时间。在预试验中，可以设定不同的孵育时间点（如30分钟、1小时、1.5小时等），观察并比较各组在不同时间点的颜色变化和OD数值，选择颜色变化明显且未达到饱和状态的时间点作为正式试验的孵育时间。