HE染色过程中常见问题分析及应对策略

生物科研实验室

苏木精 - 伊红染色法（HE 染色法），作为石蜡切片技术里的经典染色手段，在组织学、胚胎学以及病理学的教学和科研当中得到了广泛运用。该方法借助碱性的苏木精让细胞核以及胞质核酸呈现出紫蓝色，而酸性的伊红能够使细胞质与细胞外基质染上红色。 常见问题及解决办法 一、着色异常（过深或者过浅） 着色不恰当往往是由于染色时间把控有误造成的。HE 染色需要通过镜检来精准把控时间，预实验能够帮助明确最佳的染色时长。一般来说，新鲜苏木素的染色时间大概在 1 - 3 分钟，分化时间同样需要适中，过度分化之后可以通过水洗并且再次复染苏木素来进行调整。 二、切片清晰度问题（雾化、斑点） •烤片的温度或者时间不够，致使脱蜡不彻底，切片上面留存有白色的斑点。应当提高烤片的温度或者延长烤片的时间。 •脱水的步骤不合适，切片上残留的水分引发了雾化。需要优化脱水的流程，特别是在低浓度乙醇当中停留的时间应当较短，随着乙醇浓度的升高，脱水的时间逐步延长。 •盖玻片上封固剂有残留，对切片的清晰度造成了影响。这种情况下需要重新封片来消除影响。 •组织自溶、固定不及时或者固定液浓度不够，以及固定之前组织干枯，都有可能致使染色后出现灰染的现象，并且难以进行补救。 •固定剂不但具有媒染的作用，可以和蛋白以及染料相结合来增强着色，还能够沉淀以及凝固细胞内的成分，产生光学上的差异。所以，固定不佳是切片染色模糊的主要原因。 •像淋巴结这类细胞密集、结构复杂的组织，在固定的时候容易因为固定液渗透不均匀从而导至中央部分固定不好，出现发灰的情况。可以采用无水乙醇与乙醚等量的混合液来处理切片 5 - 10 分钟，随后用乙醇和水进行洗涤，再用 3%硫酸铁铵溶液补充媒染 5 分钟，以此来改善染色的效果。 三、染色切片出现黑色杂质与气泡问题 •杂质主要来源于苏木素染液当中金属膜附着在载玻片上，建议每天染色之前严格过滤苏木素染液，或者采用半氧化苏木素来减少杂质。 •切片在脱水环节如果梯度乙醇处理得不彻底，会造成封片之后水分残留以及气泡的产生，需要保证脱水完全。 四、细胞核呈现棕色问题 原因在于苏木素染液过度氧化或者返蓝的时间不足。在染色之前应当验证苏木素的活性并且适时进行更换，同时适当增加返蓝的时间来纠正颜色。 五、切片染色不均的解决策略 •组织固定不当会导至染色不均，比如组织过大过厚致使固定不充分，应当保证标本用 4%中性甲醛充分固定，并且固定液的体积需要是标本的四倍，大标本需要分割进行固定。 •切片的质量影响着染色的均匀性，切片刀受损会造成切片断裂、不完整，倾角不合适会引起切片卷曲或者皱褶，设备螺丝松动或者操作时手抖都有可能导至切片厚薄不一样或者产生横纹，需要定期检查切片的器械并且稳定操作。 •组织处理流程当中的脱水、透明、浸蜡步骤需要严格把控，乙醇浓度不足会导至脱水不彻底，二甲苯浸泡时间过长会让组织变脆，浸蜡温度过高也会影响切片的染色效果，都需要按照规范操作来避免染色不均。