RNA提取：TRNzol法原理步骤及常见问题

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RNA 是一种核酸分子，在生物学中扮演着重要的角色。在细胞内，RNA 不仅具有转录和翻译的功能，而且在调控基因表达、细胞信号传导以及病理机制等方面也发挥着重要的作用，了解更多RNA介绍可参考:《一文读懂mRNA rRNA tRNA结构和功能》目前普遍使用的RNA提取方法有两种：Trizol法和柱离心法，本文主要介绍一下Trizol法的基本原理及实验步骤。

Trizol法的实验原理(异硫氰酸肌-酚-氯仿一步法)
TRIZOL 试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持 RNA 的完整性。试剂主要成分为异硫氰酸和苯酚，其中异硫氰酸肌可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使 RNA 与蛋白质分离，并将 RNA 释放到济液中。加入氯仿后离心，样品分成水样层(无色)和有机层(黄色)。RNA 存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的 DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的 DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。




图源：解螺旋
Trizol法提取RNA操作步骤
需要的试剂：

1.氯仿
2.异丙醇
3.75%乙醇（in DEPC-treated water)
RNase free水或者0.5% SDS溶液 [准备不含RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC) to 0.01% (v/v)。静置过夜，然后高压灭菌。0.5% SDS溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水]

1、匀浆并裂解样本：
组织样本：每10~100mg组织加入1ml TRNsol，建议使用机械匀浆器来匀浆。另外也可 用液氮来破碎组织，用研钵、研杵把组织粉碎后，把粉末转移至一干净的1.5ml小离心管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。。样本的体积应不超过所使用的TRNsol的体积的10%，否则会出现DNA污染。

悬浮培养的细胞：离心沉淀收集细胞。1ml的TRNsol试剂可用于处理(5~10)×106个动物、 植物或酵母细胞，或1×108个细菌细胞。在加入TRNsol前应避免洗涤细胞，因为这样可以 增加mRNA降解及RNA酶污染的可能性。对植物、真菌和酵母细胞，通常需要进行机械匀 浆或酶解。

单层贴壁培养的细胞：通过直接把1ml TRNsol加至一直径为3.5cm的培养皿的方法来裂 解细胞，用枪头吹打裂解物几次。TRNsol的用量随培养皿的面积而定（1ml/10ml）。如果 加的TRNsol不足，则会导致在分离得的RNA中有DNA污染。如果裂解物用枪头吸起来时很 粘稠，往往需多加些TRNsol。
血液样品：250μl的新鲜全血加750μl TRNsol，剧烈颠倒混匀。注：第二步操作中，加 入氯仿的量为0.2ml。

捷倍斯生物GBCBIO的 TRNsol(Total RNA solution-R1106）是一种改进型一步法RNA抽提试剂盒，基于异硫氰酸胍/苯酚法的 一种即用的从细胞和组织中提取总RNA的试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRNsol可保持RNA 完整性，同时裂解细胞，溶解细胞内含物。

2、相分离
每1 ml TRNsol中加0.2 ml 氯仿。盖上离心管盖子，剧烈地振荡15sec，在冰上孵育5 min。室温 下，12,000×g下离心10min。此时混合物分成三层：底层为苯酚氯仿相层（红色），中间层，和上层水相层（无色）。水相占总TRIZOL的60%，RNA完全存在于水相中。

3、RNA沉淀
转移不多于80%上层水相至新的离心管中，往水相中加入异丙醇，每使用1ml的TRNsol，加入 500μl的异丙醇(注：如果是含多糖、多酚的植物样品，请加入300μl异丙醇的同时加入300μl 0.8M 柠檬酸钠/1.2M NaCl混合液)。涡旋混匀，室温下放置10min，然后在4度下12,000×g离心10min，离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。。糖类丰富的样本：富含多糖的植物样本或富含糖胺聚糖和蛋白质聚糖的动物样本需要使用以下的 修饰的沉淀方法来获得纯的RNA。准备1份Buffer A（1.2M NaCl，0.8M柠檬酸钠）。做完第二步后， 紧接着依次往水相中加入异丙醇和Buffer A （1ml TRNsol加0.3ml的异丙醇和0.3ml的Buffer A）。旋涡混匀，并在室温下,≤12,000×g离心10min，这一高盐沉淀会减少复杂糖类的共同纯化。

捷倍斯生物GBCBIO的 植物RNA提取试剂盒(Plant RNA Kit-R5105）采用独特的独特的缓冲液系统与硅胶膜纯化技术，简化了总RNA抽提。无需CsCl纯化过程的超离心步骤和LiCl或乙醇沉淀，富含多糖多酚的样品同样适用。此外，该产品还结合了高效的gDNA过滤技术，可高效去除基因组DNA。纯化得到的RNA几乎不含DNA污染，无需进行DNase酶进行消化。Plant RNA Kit适合于从小于100mg植物样品中提取高达100ug的总RNA。30分钟内就可完成数个样品的提取工作。纯化的RNA可直接用于RT-PCR，荧光定量RT-PCR，Northern杂交，第二代测序运用等。

4、RNA洗涤
洗涤RNA:弃上清， 并用75%乙醇洗涤沉淀一次。旋涡混和样本，并在室温下以不超过7,500×g 的速度离心样本5min。注意：75％的乙醇必须用DEPC处理过的灭菌水来配制，否则75％乙醇中 残留的RNaseA会降解RNA。5. RNA的溶解:小心地吸弃乙醇，短暂离心将溶滴甩到管底，用移液枪小心吸弃残留的溶液。室 温下空气干燥RNA 5-10min。不要用离心干燥装置或真空干燥装置，因为过度干燥会导致很难用 水重新溶解RNA。加入适当的DEPC水溶解RNA。

5、RNA再溶解
去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心干燥）。注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。部份溶解的RNA样品其A260/280 ratio < 1.6。
用无RNase 水或0.5% SDS溶液重悬RNA沉淀，用枪头反复吹打几次，静置10分钟，55-60°C。测浓度后-20°C保存。


6、测浓度：
取2μl 储存液加入另一个EP管中，再加入98μl无RNase水，离心混匀，以无RNase水作空白对照，测OD260/280值。1 OD=40μg RNA。OD260/280值在1.8-2.0视为纯度很高。一般浓在1000ng/ml较准。浓度太高要稀释以后再测定。

7、RNA鉴定：
甲醛变性琼脂糖电泳，确定抽提RNA完整性和DNA污染情况。
想了解核酸电泳可参考：《一文读懂琼脂糖凝胶电泳实验》


Trizol法提取RNA有哪些注意事项？

在使用TRIZOL的时候要带手套和眼罩，避免接触到皮肤和衣服，使用化学通风橱，防止蒸汽吸入。

从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。

匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75%酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：肝和脾6-10μg ,肾3-4μg ,骨骼肌和脑组织1-1.5μg ,胎盘1-4μg ,上皮细胞8-15μg ,成纤维细胞5-7μg。Trizol法提取RNA有哪些常见问题？得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底B．RNA沉淀未完全溶解
OD260/OD280<1 .65：
A.检测吸光度时，rna样品没有溶于水，而溶于了TE中
   低离子浓度和低ph值条件下a280值偏高
B．样品匀浆时加的试剂量太少
C．匀浆样品时未在室温放置5分钟D．吸取水相时混入了有机相E．RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解：
A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.细胞在用胰酶处理时过度
D.溶液或离心管未经RNase去除处理
E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5

捷倍斯生物 GBCBIO 的RNAlocker (RNA Stabilization Reagent-R9106)  采用创新的液体RNAlater RNA 稳定试剂可迅速渗入组织，稳定和保护RNA的表达量。RNAlater技术迅速的保护作用确保了下游分析结果准确地反映了组织的基因表达谱。样本可长期保存，即使是多次反复冻融RNA也不会降解。利用RNeasy技术纯化储存在各种条件下的经RNAlater稳定后的样本，获得的RNA非常适合于各种下游应用，如Northern印迹杂交和RT-PCR
更多RNA提取技巧可参考：《RNA提取7大技巧 让实验不再七上八下》

DNA污染:
A.样品匀浆时加的试剂量太少B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液
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捷倍斯生物官网：http://www.gbcbio.cn/
RNA提取试剂推荐

样品类型	推荐试剂（品牌+货号）
通用	RNAlocker  RNA Stabilization Reagent （GBCBIO-R9106）
TRNsol/TRNzol（GBCBIO-R1106）TRNsol LS Reagent（GBCBIO-R1606）
哺乳动物组织	Tissue RNA Kit（GBCBIO-R3105）FFPE RNA Kit（GBCBIO-R7105）miRNA Isolation Kit（GBCBIO-R8015）
Blood RNA Kit（GBCBIO-R2015）
Stool RNA Kit（GBCBIO-D1305）
Total RNA Kit（GBCBIO-R4105）
植物	Plant RNA Kit（GBCBIO-R5105）Plant RNAplus(溶液法）（GBCBIO-R1605）
真菌	Fungal RNA Kit（GBCBIO-D6105）
细菌	Bacterial RNA Kit（GBCBIO-R1405）
其他	MagIso Virus DNA/RNA Isolation Kit（GBCBIO-M6105）
Water RNA Ki（GBCBIO-R1805）

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