文献分享|利用量子点进行高特异性RNA成像

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文献分享|利用量子点进行高特异性RNA成像
【背景】
单分子荧光原位杂交（smFISH）是一种强有力的工具，用于RNA成像及其生物学研究。通过smFISH技术，研究人员能够可视化转录等生物过程，从而加深对细胞内基因表达调控的理解。然而，传统smFISH在特异性和灵敏度方面存在一定局限性，这使得在临床上确定RNA生物标志物的表达水平变得困难。此外，核酸探针的变性和脱靶现象也导致了较低的特异性和较高的背景信号。在识别低丰度mRNA时，荧光染料的强度有限，进一步影响了测定的准确性。
为了克服这些挑战，湖南大学的的谭蔚泓团队在ACS Nano期刊发表了题为“Enhancing Specific Fluorescence In Situ Hybridization with Quantum Dots for Single-Molecule RNA Imaging in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tumor Tissues”的研究论文，本研究提出了一种新型的单分子RNA成像技术——量子点增强的分裂探针荧光原位杂交技术（QD-split-FISH）。该技术结合了高亮度的量子点和分裂DNA探针，不仅提升了信号强度和稳定性，还增强了探针与目标mRNA之间的特异性，从而显著提高了RNA成像的灵敏度和准确性。



【结果】
1.QD-split-FISH技术的设计与工作流程
QD-split-FISH技术通过多步杂交过程增强了RNA探针的特异性和信号强度。首先，研究人员设计了特定的分裂DNA探针，这些探针被分为两部分，分别与目标mRNA的不同序列区域结合。接着，使用桥联探针将这两部分分裂探针连接起来，形成一个完整的探针复合体。最后，加入标记有量子点的读出探针，它能够与桥联探针的突出端结合，从而实现信号的放大和稳定。量子点的高亮度和长时间光稳定性使得这种新型探针能够在高背景的复杂样本中提供清晰、持久的成像信号。



图1 QD-split-FISH技术的设计与工作流程
2.验证实验与结果分析
为了验证QD-split-FISH在单细胞RNA成像中的有效性，研究人员在SKBR3乳腺癌细胞系中比较了三种不同的FISH技术：传统的smFISH、量子点标记的smFISH（QD-smFISH）和QD-split-FISH。通过对比这些方法在细胞内的荧光标记强度和信号稳定性，结果表明，QD-split-FISH在荧光强度、斑点数量和信号稳定性方面优于传统方法，能够更精确地捕捉低丰度的mRNA。



图2不同smFISH探针设计用于SKBR3细胞中HER2转录物分析
3.特异性与灵敏度验证
为确保该技术的高特异性，研究人员通过一系列控制实验验证了QD-split-FISH的准确性。首先，在SKBR3细胞中采用TSA（过表达标记）处理后，QD-split-FISH显示出低假阳性信号，证明了其在复杂背景下的特异性。接着，通过移除部分分裂探针或仅使用量子点标记的读出探针进行成像，结果表明，只有完整的分裂探针体系才能确保最佳的信号强度，进一步验证了分裂探针设计对信号放大的关键作用。



图3验证QD split-FISH特异性
4.在临床样本中的应用
除了细胞培养模型，QD-split-FISH还被应用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本中的RNA成像。研究团队在乳腺癌和肺鳞癌等FFPE临床样本中成功检测了HER2和PD-L1 mRNA的表达水平。通过在不同表达水平的临床样本中进行成像，发现QD-split-FISH能够清晰区分高表达和低表达区域，且在临床样本中的信号表现与实验室细胞系中的结果一致。这表明，QD-split-FISH具有很好的临床转化潜力，能够在FFPE组织样本中提供高灵敏度、高特异性的RNA成像。



图4不同FFPE临床组织样本的QD split-FISH mRNA成像
【小结】
本研究提出的QD-split-FISH技术通过结合量子点和分裂探针的创新设计，显著提高了RNA成像的灵敏度、特异性和信号稳定性。与传统的smFISH方法相比，QD-split-FISH在低丰度mRNA的检测上具有明显的优势，且能够有效避免高背景和低信号的问题。该技术不仅成功应用于乳腺癌细胞系，还在临床FFPE组织样本中展现了强大的应用潜力，特别是在肿瘤分子诊断和转录组学研究中。随着对该技术的进一步优化，QD-split-FISH有望成为临床RNA检测中的新标准，为癌症早期诊断、治疗监测和转化医学研究提供重要支持。
原文及图片来源：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.3c10216

（撰稿：23级博士研究生徐一鸣   修改：李鹏飞）
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原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/18757499703