25考研丨细胞生物学研究方法（下）丨细胞生物学知识一轮复习

Rose

细胞生物学研究方法




01
超速离心技术

1.差速离心
用低渗匀浆、超声破碎或研磨等方法可使细胞质膜破损。形成细胞核、线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体、溶酶体等细胞器和细胞组分组成的混合匀浆，再通过差速离心，即利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开。



2.密度梯度离心
【定义】是将要分离的细胞组分小心地铺放在含有密度逐渐增加的、高溶解性的惰性物质%28如蔗糖%29形成的密度梯度溶液表面，通过重力或离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率沉降，形成不同的沉降带。各组分的沉降率与它们的形状和大小有关，通常以沉降系数%28S值%29表示。



【分类】速度沉降和等密度沉降
（1）速度沉降
【应用】速度沉降主要是用于分离密度相近而大小不一的细胞组分。
【原理】离心前，将要分离的细胞匀浆物放置在蔗糖浓度梯度%28通常质量分数范围为5%- 40%%29 溶液的，上层，各种细胞组分根据它们的大小以不同的速度沉降，形成不同的沉降带，然后分别收集不同的沉降带中的组分，用于分析。
（2）等密度沉降
【应用】等密度沉降用于分离不同密度的细胞组分。
【原理】细胞组分在连续梯度的高密度介质中经离心力场长时间的作用沉降或漂浮到与自身密度相等的位置，形成不同的密度区带。这种方法非常灵敏，甚至可以将掺入重同位素。
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02
细胞成分细胞化学显示方法

1.福尔根反应:福尔根反应可特异显示DNA的存在部位%28福尔根反应――核酸%29

2.PAS反应:PAS反应可确定多糖的存在 %28PAS----多糖%29
3.四氧化饿反应︰四氧化铺可证明脂肪滴的存在（四氧化钱-----脂肪%29
4.苏丹Ⅲ:苏丹Ⅲ也常用于脂肪的鉴定%28苏丹Ⅲ---脂肪%29
5.米伦反应及重氮反应:用来测定蛋白质（米伦反应及重氮反应――蛋白质%29
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03
特异生物大分子定性与定位

蛋白质分子定位技术：免疫荧光、免疫电镜
蛋白质组分体外分析定性：免疫印迹、放射免疫沉淀、蛋白质芯片、质谱分析
1.免疫荧光
【定义】将免疫学方法（抗原-抗体特异结合）与荧光标记技术相结合用于研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法
【类型】直接免疫荧光和间接免疫荧光



【实验步骤】荧光抗体的制备、标本的处理（组织切片/冷冻切片/整装细胞）、免疫染色和观察记录

【特点】需要尽量保证被检测蛋白的抗原性，常与激光扫描共焦显微镜一起使用

2.免疫电镜
【特点】样品分辨率提高，制样过程中既要保持样品中蛋白的抗原性，又要尽量保存样品的精细结构
【应用】在超微结构水平上研究蛋白抗原的定位
【类型】免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术、免疫胶体金技术
【样品制备】固定、包埋、超薄切片制备、免疫标记、染色

3.特异核酸的定位与定性
原位杂交（in situ hybriduzation）
【定义】用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法
【步骤】放射性同位素标记的探针与样品中的DNA或RNA杂交后，用显微放射自显影的方法显示杂交物的存在部位或用荧光素标记的探针进行杂交，在荧光显微镜下直接显示细胞中与探针杂交的特异核酸。
【意义】原位杂交技术在显微与亚显微水平上研究基因定位、特异mRNA表达等问题的研究中具有重要作用。

4.细胞成分分析和细胞分选技术
流式细胞术（flow cytometry）
【定义】可定量地测定某一细胞中的DNA、RNA或某一特异的标记蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量，它还可将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，以及将DNA含量不同的中期染色体分离出来，甚至可用于细胞的分选的一种技术。
【原理/步骤】细胞群体一般需要分散后对待测的某种成分进行特异的荧光染色，然后使悬液中的细胞一个个快速通过流式细胞仪%28每秒可达几万个细胞%29。当含有单个细胞的液滴通过激光束时，带有不同荧光的细胞所在的液滴被充上正电荷、负电荷,或不被充电，同时检测器可测出并记录每个细胞中的待测成分的含量。因带有不同表面标志的细胞所带的电荷的种类不同，当液滴通过高压偏转板时，带不同电荷的液滴发生偏转,从而达到将细胞分选的目的。如果染色过程不影响细胞活性，那么分离出来的细胞还可以继续培养。

流式细胞仪（flowcytometer）
【定义】是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪又被称为荧光激活细胞分类仪，是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。
【应用】流式细胞仪主要有两个最基本的用途：第一是可以定量分析鉴定活细胞表面表达的特异分子，第二是进行特定的活细胞群的分离和纯化。
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04
细胞培养

1.动物细胞培养分类
（1）原代细胞培养
原代细胞（primary culture cell）指从机体取出后立即培养的细胞，也有人把传至10代以内的细胞统称为原代细胞培养
步骤：首先取出健康动物的组织块，剪碎；用浓度与活性适中的胰酶或胶原酶与EDTA %28整合剂%29等将细胞连接处消化使其分散；给予良好的营养液与无菌的培养环境%28接近体温与体内pH%29，在培养中进行静置或慢速转动培养；一般都要加一定量的小牛%28或胎牛%29血清，这样细胞才能很好地贴璧生长与分裂。
（2）传代细胞培养
①传代细胞（subculture cell）：适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞称为传代细胞
②单层细胞%28single layer cell%29：分散呈圆球形的细胞一经贴壁就迅速铺展并开始有丝分裂，逐渐形成致密的细胞单层
③细胞系%28cell line%29：原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞生长出现停滞，大部分细胞衰老死亡，但有极少数细胞可能渡过“危机”而传下去。这些存活的细胞一般又可顺利地传40~50代次，并且仍保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制的行为，很多学者把这种传代细胞称作细胞系
④有限细胞系%28finite cell line%29：一般情况下%28胚胎干细胞等除外%29，当细胞传至50代以后又要出现“危机”，难以再传下去。这种传代次数有限的体外培养细胞通常称为有限细胞系
永生细胞系%28infinite cell line%29/连续细胞系%28continuous cell line%29
【定义】在传代过程中如有部分细胞发生了遗传突变，并使其带有癌细胞的特点，有可能在培养条件下无限制地传代培养下去，这种传代细胞称为永生细胞系
【特点】染色体明显改变，一般呈亚二倍体或非整倍体，失去接触抑制，容易传代培养。
⑤细胞株%28cell strain%29：用单细胞克隆培养或通过药物筛选的方法从某一细胞系中分离出单个细胞，并由此增殖形成的、具有基本相同的遗传性状的细胞群体称为细胞克隆。该细胞群体经过生物学鉴定，如具有特殊的遗传标记或性质，这样的细胞系称为细胞株。

2.植物细胞培养
①单倍体培养：主要用于花药在人工培养基上进行培养。可以从小孢子%28雄性生殖细胞%29直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株。单倍体细胞培养在植物育种中已取得了很大成就。
②原生质体（protoplast）培养：一般用植物体细胞，经纤维素酶处理去掉细胞壁，得到原生质体，原生质体在无菌培养基中生长分裂经过诱导分化最终长成植株。
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05
细胞工程
细胞工程主要涉及的技术包括：细胞培养、细胞分化的定向诱导、细胞融合和显微注射等
1.细胞融合以及单克隆抗体技术
（1）细胞融合（cell fusion）
【定义】是指两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞的现象。
【过程】细胞融合形成异核体、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。
【应用】细胞融合可以发生在基因型相同的细胞间进行，也可以在基因型不同的种内细胞间甚至种间细胞间进行。被广泛应用于核质关系研究等领域。
（2）细胞融合的方法
①病毒诱导融合：灭活的仙台病毒，原理：仙台病毒外壳上的某些糖蛋白可能具有促进细胞融合的功能。其优点为融合率高，适用范围广，能大量在鸡胚中繁殖（来源广泛），缺点为制备过程繁琐，活性易降低；
②化学诱导融合：PEG（聚乙二醇），原理：它可引起邻近的细胞膜黏合，继而使细胞融合成为一个细胞。其优点为非常方便，没有繁琐的制备步骤，缺点为其有一定的毒性，使用范围窄；
③物理诱导融合：电融合技术，原理：悬浮细胞在低压交流电场中聚集成串珠状细胞群，或对互相接触的单层培养细胞，再施加高压电脉冲处理使其融合。其优点为无毒性，操作简便，诱导频率高。
（3）单克隆抗体（monoclonal antibody）
【定义】在细胞融合的研究基础上建立的细胞工程技术。
【特点】最主要优点是可以用混合性的异质抗原制备出针对某单一性抗原分子上特异决定簇的同质性单克隆抗体。此外单克隆抗体特异性强、敏感性高且具有均一性。
【步骤】目的抗原的免疫→细胞融合→杂交细胞的选择性培养、检测→克隆化培养→单抗检测与扩大培养→抗体生产
【原理】动物受到外界抗原刺激后可激发B淋巴细胞活化，产生相应的抗体,但B淋巴细胞在体外难以增殖,而一些骨髓瘤细胞[TK%28胸苷激酶%29或HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖%29）缺陷型]不分泌抗体,但在体外培养条件下可以无限传代。



把小鼠骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞（B淋巴细胞%29在聚乙二醇或灭活的病毒的介导下发生融合。融合后的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，一方面可分泌抗绵羊红细胞的抗体，另一方面像肿瘤细胞一样,可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖。由于骨髓瘤细胞缺乏TK 或HGPRT，在含氨基蝶呤的培养液内不能成活。只有融合细胞才能在含HAT（次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺咤啶核苷%29的培养液内通过旁路合成核酸而得以生存。通过HAT选择培养和细胞克隆,可以获得能大量分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

2.显微操作技术与动物克隆
（1）细胞拆合
【定义】就是把细胞核与细胞质分离开来，然后把不同来源的胞质体（cytoplast%29和核质体%28karyoplast%29相互组合，形成核质杂交细胞。
【类型】细胞拆合可以分为物理法和化学法两种类型。物理法就是用机械方法或短波光把细胞核去掉或使之失活，然后用微吸管吸取其他细胞的核,注入去核的细胞质中，组成新的杂交细胞。这种核移植必须用显微操纵仪进行操作。化学法是用细胞松弛素B %28cytochalasinB%29处理细胞，细胞出现排核现象，再结合离心技术，将细胞拆分为核质体和胞质体两部分。

（2）显微操作%28micromanipulation%29技术
【定义】是早期建立的一种实验胚胎学技术，即在显微镜下,用显微操作装置对细胞进行解剖和微量注射（microinjection%29的技术。
【应用】现在显微操作装置的设计愈来愈精密，不仅用于核移植，而且亦可对细胞核进行解剖和向核内注入基因。
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06
生物大分子动态变化
检测技术

1.荧光漂白恢复技术（fluorescence photobleaching recovery，FPR）
【定义】是指使用亲脂性或亲水性荧光分子，如绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联，用于检测所标记分子在活体细胞表面或细胞内部的运动及其迁移速率的一种技术



【原理】利用高能激光束照射细胞的某一特定区域，使该区域内标记的荧光分子发生不可逆的淬灭，这一区域称为光漂白区，由于细胞中脂质分子或蛋白质分子的运动。结果使光漂白区的荧光强度逐渐恢复到原有水平。这一过程称为荧光恢复。荧光恢复的速度在很大的程度上反映荧光标记的脂质或蛋白质在细胞中的运动速率。
2.酵母双杂交技术（yeast two-hybrid system）
【定义】是一种利用单细胞真核生物酵母在体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的系统。
【原理】真核生物基因转录起始需要转录激活因子参与，转录激活因子一般由两个或两个以上的相互独立的结构域构成，即DNA结合域（DB）和转录激活域（AD）。前者可以识别DNA上的特异转录调控序列并与之结合；后者可与其他成分作用形成转录复合体，从而启动它所调节的基因的转录。



【步骤】要证明蛋白A与蛋白B是否在细胞内相互作用，或寻找蛋白A可能发生作用的融合蛋白，则可分别制备DB与蛋白A的融合蛋白，以及AD与蛋白B或可能与蛋白A发生作用的蛋白的融合蛋白。如果蛋白A与蛋白B或其他蛋白在细胞内相互结合，则可形成与转录激活因子类似的具有DB和AD结合域的复合物，从而启动报告基因的表达。反之，报告基因不表达。

【应用】可用于哺乳动物，也可用于高等植物蛋白质之间的相互作用
3.荧光共振能量转移技术（ fluorescence resonance energy transfer，FRET）
【定义】用于检测活细胞中两种蛋白质分子是否直接相互作用的重要手段。荧光共振能量转移的效率在很大程度上，反映了细胞内两种蛋白质相互作用的可能性与作用的强弱。



【原理】 一定波长的激发光照射下，只有携带发光集团A的供体分子可被激发出波长为A的荧光，同一激光发光不能激发携带发光基团B的受体分子发出波长为B的荧光。但当供体发出的荧光光谱A与受体上的发光基团的吸收光谱B相互重叠，并且两个发光集团之间的距离小到一定程度时，就会发生不同程度的能量转移，受体分子的发光集团吸收了供体所发出的荧光，结果受体分子放出了波长为B的荧光，此现象称为FRET现象。在体内，如果两个蛋白质分子的距离在10nm之内，就可能发生FRET现象，由此认为这两个蛋白质存在直接的相互作用。
4.放射自显影技术（autoradiography）
【定义】是利用放射性同位素的电离射线对乳胶（含AgBr或AgCl%29的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。
【应用】可以对细胞或生物体内生物大分子进行动态研究和追踪
【步骤】同位素标记的生物大分子前体的掺入和细胞内同位素所在位置的显示。
【类型】研究DNA合成时通常用氚（3H%29标记的胸腺喀啶脱氧核越%283H-TdR%29，研究RNA合成用标记的尿密啶核苷%283H-U%29;在研究含硫蛋白分子代谢时，可用35S标记的蛋氨酸和半胱氨酸，3H或14C标记的蛋氨酸、亮氨酸等也是常用于蛋白质合成的前体化合物。、
显微放射自显影的基本实验步骤如下:
首先用合适的放射性前体分子标记机体或细胞,根据实验的需要,按标记的持续时间分为持续标记和脉冲标记。
标记后的组织与细胞可按常规方法制片,在暗室中向样品表面均匀地敷一层厚3~10 um的乳胶膜,然后在暗盒中曝光%28或称自显影%29数天,再经显影、定影后于显微镜下观察。细胞中银颗粒所在的部位即代表放射性同位素的标记部位。
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07
模式生物

1.模式生物（model organisms）
【定义】生物学家通过对选定的生物物种进行科学研究，用于揭示某种具有普遍规律的生命现象，这种被选定的生物物种就是模式生物
【特点】通常具有个体较小，容易培养，操作简单，生长繁殖快的特点
【常用】噬菌体、大肠杆菌、酵母
2.种类及应用
大肠杆菌（Escherichia coli）：大肠杆菌是原核细胞的代表之一，常被用作模式生物已经广泛应用于分子生物学研究。其特点是培养方便、生长快、基因结构简单，突变株的诱变，分离和鉴定容易，转基因技术成熟，进行基因定位简单易行。
酵母（saccharomyce）：酵母是单细胞真核生物的代表，用于生物学研究的酵母主要有两种：芽殖酵母和裂殖酵母。酵母具有真核细胞的组织结构——细胞核和各种细胞器，生长迅速并且易于遗传操作，具有与细菌类似的一些优点，常用于蛋白质相互作用、细胞周期、基因表达调控等研究方向。
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）：在实验室中常用的线虫之一，是细胞生物学研究常用的模式生物，其特点为遗传背景清楚、培养方便、生长快、基因结构简单、突变株的诱变分离和鉴定容易，转基因技术成熟，进行基因定位简便易行。且其通体透明，可以追踪体内每一个细胞的形成，胚胎发育过程中细胞分裂、分化、死亡具有高度程序性，细胞凋亡的现象和机理最早是在线虫上发现的。
黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）：实验室常用的模式生物之一，它具有丰富的表型特征，基因组序列已测定，许多基因在进化上保守，与人类基因有很高的同源性，易于遗传学操作，曾在遗传分析，染色体特性研究、胚胎发育的基因调控和细胞分化机制研究等发挥重要作用。
斑马鱼（Danio rerio）：斑马鱼属于一种小型脊椎动物，常用模式生物之一，基因组数与人类相近，许多基因与人类的基因存在一一对应的关系，很容易饲养，3个月性成熟、产卵多、胚胎体外发育，利于研究胚胎发育过程中细胞行为。且其鱼卵和胚胎是透明的，对胚胎发育过程中细胞行为的观察与研究极为便利。
小鼠（Mus musculus）：小鼠是一种小型哺乳动物，常用模式生物之一，遗传背景清楚，在进化方面最接近人类，可用于建立人类疾病的小鼠模型、转基因小鼠、基因打靶、条件基因打靶、RNA干扰等。
拟南芥（Arabidopsis thaliana）：拟南芥是一种十字花科植物，常用模式生物之一，广泛应用于植物遗传学、发育生物学、细胞生物学和分子生物学的研究。其特点为个体小、生长周期快、生活力强。此外拟南芥是自花授粉植物，容易获得各种突变株，其研究结果对水稻、蔬菜等其他经济作物的研究均有重要的借鉴作用。
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