PCR实验小问题②——条带失踪

HaHa

在我们的PCR实验中，结果条带会出现各种各样的问题，之前那期我们系统分析了可能会出现的非特异性扩增问题，那么今天我们就来一起讨论一下条带失踪的可能原因吧！
1. 引物。引物的质量、浓度都会影响我们最后的试验结果。①首先要确保我们的引物设计是否合理，引物长度，GC含量等均会影响试验结果。②引物浓度过低或不对等，引物一般稀释到100uM或10uM进行储存和使用，如果引物的浓度过低，或者一高一低，就会导致扩增结果的不理想。③引物质量问题。首先我们应该找到一个靠谱的引物合成机构，另外引物应该在稀释时进行少量分装，避免反复冻融或长期冷藏保存影响引物质量。
2. Mg2+离子浓度。Mg2+离子浓度是PCR扩增的重要影响因素，过高会降低PCR扩增的的特异性，出现杂带；过低则会导致PCR扩增产量低，甚至没有条带。
3. 酶。酶在PCR反应中非常关键，添加量虽然不多，但是一旦酶的活性过低，或酶完全失活，都会导致PCR反应失败，即没有目的条带。所以在使用新酶时我们要与旧酶进行比对验证，确保酶的质量没有问题，并且在保存过程中避免酶的反复冻融。
4. 模板。模板就是我们提取出来的生物体核酸，模板质量也会影响PCR的效果。①模板不纯，含有杂蛋白或者染色体中的组蛋白等蛋白质没有消除干净。②模板制备时裂解、消化不到位导致浓度过低，或根本没有提取出来核酸，也会导致目的条带不出。所以在提取核酸时一定要按照操作流程严谨制备，以防做了无用功哦！
5. PCR程序。变性是打开DNA双链的高温阶段，如果变性温度过低或时间过短，双链打开不彻底，则很有可能结果跑不出条带，即假阴性。也有可能是你仪器温度不准啦！
6. PCR体系。有一种最简单的可能，就是没有加全成分；或者体积扩大或缩小等多种情况导致的反应体系不合理也会让扩增结果不理想。
PCR技术说简单也简单，说复杂也很复杂，一点小的不足就很有可能与正确结果擦肩而过，此之谓牵一发而动全身。所以严谨的试验态度非常重要，同样重要的还有优质的试剂与仪器。三狮生物推出了多个种类、多种规格的核酸提取试剂盒，Taq酶，Taq酶预混液等普通PCR试验的全线商品，以及琼脂糖、TAE速溶粉末，核酸染料，上样缓冲液等全套琼脂糖凝胶电泳所需试剂，总有一款适合你，赶快行动起来吧！

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