图解微流控｜第25期

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检测技术（一）
一套完整的微流控芯片实验室大体应包括三个部分：一、承载不同功能的微流控芯片；二、支撑芯片流体控制及信号采集的控制和检测装置；三、完成芯片功能化的试剂盒[1,2]，如图9-1所示。本章将对微流控芯片实验室所涉及的各种检测技术作一介绍。



图9-1 微流控芯片系统整体组成示意图

9.1 微流控芯片对检测的特殊要求
对于常规的生物或化学实验室来说检测都是其不可或缺的一步，而用以取代常规生物或化学实验室各种功能操作的微流控芯片实验室同样也离不开检测这一基本过程。以微流控芯片实验室为平台进行的各种化学、生物学反应、分离等通常都发生在微米量级尺寸的微结构中，这同传统意义上的类似操作有很大差别。为此，微流控芯片实验室对检测器的要求也较传统检测器更为苛刻。这主要体现在以下三个方面：

一、灵敏度高
在微流控芯片运行过程中，可供检测物质的体积微小（微升、纳升甚至皮升级），且检测的区域一般也非常小，这就要求检测器应具有更高的检测灵敏度。图9-2所示为传统比色皿与微通道实物比较图。


图9-2 传统比色皿与微通道实物比较图
微通道50 μm宽，20 μm深

二、响应速度快
由于芯片微通道尺寸较小，许多混合反应及分离过程往往在很短时间内（秒级甚至更短）即可完成，因此要求检测器具有更快的响应速度。
三、体积小
芯片实验室的最终目的是将尽可能多的功能单元集成在同一块微芯片上，因此，要求作为输出终端的检测器具有较小的体积，最好能直接集成在芯片上。如图9-3所示为传统检测器与掌上检测器实物比较图。


图9-3 传统检测器与掌上检测器实物比较图

自微流控芯片问世以来，检测器的研究一直是人们关注的热点。迄今为止，已发展出十几种微流控芯片检测技术，其中以光学检测法和电化学检测法应用最为广泛。由于芯片电泳曾经是微流控芯片早期的主要形式，微流控芯片在一定程度上承袭了毛细管电泳的特征，激光诱导荧光、化学发光和紫外吸收等光学检测至今仍是其主流检测手段。各种电化学检测器因其结构简单，价格低廉，体积较小，在与芯片的整合上具有其它检测器无法比拟的优势。除此之外，质谱检测器凭借其强大的分辨和鉴定能力，在微流控蛋白质组学研究中有着难以替代的作用。本章将重点对上述几类微流控芯片检测器予以介绍。

9.2 微流控芯片检测分类
根据检测方式的不同，微流控芯片检测器一般可分为四大类，即光学检测器、电化学检测器、质谱检测器和其它检测器。本章将以图9-4所示的微流控芯片检测器分类图为脉络，对芯片检测的各种方式进行介绍。


图9-4 微流控芯片检测器分类图

9.3 激光诱导荧光检测
激光诱导荧光（laser induced fluorescence，LIF）是目前最灵敏的检测方法之一，其检测限一般可达到10-9～10-13 mol/L，对某些荧光效率高的物质，通过采用光子计数、双光子激发等技术甚至可达到单分子检测。由于微流控芯片的研究对象一般多为具有荧光官能团或可衍生产生荧光的核酸、蛋白质、氨基酸等生化样品，所以激光诱导荧光检测是至今为止使用最早、应用最广泛的光学检测手段。

许多化合物可以吸收一定波长的光，使原子中的某些电子从基态的最低振动能级跃迁到较高电子能态的某些振动能级。随后，由于电子在分子中的碰撞，损失一定能量而无辐射地下降到第一电子激发态的最低振动能级，再驰豫回到基态中的不同振动能级，同时发射出比吸收光频率低的光，即为荧光，如图9-5所示。当采用特定频率的激光作为激发光源时，会大大提高产生荧光的强度从而增加检测的灵敏度，这种方式即为激光诱导荧光。


图9-5 荧光产生原理示意图[3]

常规荧光检测器采用正交型光路设计以降低背景干扰，但对于微小尺度的微流控芯片来说则多采用共聚焦型光路设计，其示意图见图9-6。由激光器发射出的激光经滤波后被分色镜反射，再由一显微镜物镜聚焦到芯片微通道中，以激发检测物质产生出荧光；荧光由同一物镜所收集，透过二色分光镜后由发射光滤光片滤去杂色光，最后进入光电倍增管（PMT）或电感耦合器件（CCD）中检测。


图9-6 共聚焦型LIF检测器基本光路结构示意图

9.3.1 常规单通道激光诱导荧光检测
单通道微流控芯片激光诱导荧光检测器是应用最为广泛的一类LIF检测器，其基本结构如图9-6所示。
作者实验室自行研制了几种不同结构的微流控芯片分析仪。2002年10月首次推出了第一代实验室样机——通用型芯片电泳分析仪[4-7]，图9-7所示为其示意图，该仪器由内置的四电极高压电源系统和LIF光学检测系统两大部分组成。在自制玻璃芯片上利用该仪器进行芯片电泳分离，对罗丹明6 G的检测限为1×10-10 mol/L，线性范围为4.02×10-6～4.02×10-9 mol/L，峰高和迁移时间重复性良好，相对标准偏差均小于5%（n =5）。


图9-7 通用型芯片电泳分析仪光路示意图[4]

为了支撑集成式微流控芯片的研究，在上述通用型芯片电泳分析仪的基础上，作者课题组又研制推出了一台集成式微流控芯片分析仪[8]，如图9-8所示。


图9-8 集成式微流控芯片分析仪[8]
(a) 集成式微流控芯片分析仪外观；(b) 集成式微流控芯片分析仪光路示意图

该装置的微流体控制单元采用八电极直流高压电源及双注射泵联合驱动系统，可满足不同集成度芯片的驱动要求；在检测光路上，设计了一套全新的无须切换式激光诱导荧光检测及CCD图像检测耦合光学系统。
9.3.2 常规多通道激光诱导荧光检测
由于微流控芯片的平面二维特性，芯片上可以很容易的加工出上百根并行微通道，以实现高通量的反应和分离，满足基因测序和药物筛选等领域的需求。
9.3.2.1 电感耦合器件成像检测
CCD成像检测技术比较容易实现，作者课题组业已研制的阵列微流控芯片分析仪就属于这种类型[9]，其光路示意图如图9-9所示。


图9-9 带有CCD的阵列微流控芯片分析仪光路示意图[9]

以该仪器为支撑，作者课题组在自制四通道阵列玻璃芯片上完成了氨基酸、蛋白质或DNA的分别进样和电泳分离[10]。电泳分离的典型谱图如图9-10所示。


图9-10 CCD型阵列微流控芯片分析仪四通道平行进样分离典型谱图[10]

9.3.2.2 光电倍增管扫描检测

作者课题组根据已有单通道PMT激光诱导荧光检测系统改建搭造了旋转扫描激光诱导荧光检测仪，其基本结构和仪器外观如图9-11所示。


图9-11 旋转扫描激光诱导荧光仪示意图
（a） 仪器结构示意图；（b） 仪器外观图

该仪器扫描直径为2 cm，扫描速度最大为1周/s，检测灵敏度为1.0×10-9 mol/L（FITC标准品计）。课题组对激光检测平台芯片通道检测的一致性上进行了考察。在所用芯片的35个通道中加入相同浓度的FITC溶液在激光检测平台上聚焦后进行扫描检测，其相对标准偏差（RSD）为3.24%（n=35）[11]。
在上述工作的基础上，作者课题组又搭建了其它不同激发波长下的扫描激光诱导荧光检测系统用于皮质醇和睾酮免疫反应的检测，相继测定了标准曲线、实际样品浓度、实际样品回收率等，均取得了比较好的结果。图9-12为不同浓度下睾酮的标准谱图。


图9-12 不同浓度睾酮标准品谱图

9.3.3 微型化激光诱导荧光检测示例

9.3.3.1 便携式芯片电泳系统
图9-13所示的是美国桑地亚国家实验室的科学家所介绍的掌上便携式芯片电泳装置[12]。其外观尺寸仅为11.5 cm×11.5 cm×19.0 cm，却内置有两套独立的电泳分离单元，每个单元含有6个高压电源，一个微型LIF检测模块，一块石英芯片及相应的流体接口装置。


图9-13 便携式芯片电泳装置[12]
（a） 整机外观；（b） 内部结构；（c） 微型LIF检测模块；（d） 光学系统示意图
1．接合销；2．物镜；3．光束位置调节块；4．底板；5．光束控制块；6．PMT模块；7．反射镜；8．激光二极管；9．激光护罩

9.3.3.2 集成光纤和微型雪崩二极管等检测元件的芯片系统
Whitesides课题组报道了一种集成有荧光检测单元的PDMS芯片系统[13]，如图9-14所示。该芯片为多层结构，在通道层靠近分离通道的边缘固定有芯径100 μm的光纤，然后用PDMS膜封接，而在另一个PDMS基片中预埋入微型雪崩二极管作为感光元件，其上覆盖一层PC聚合物滤光片，然后将之与通道层对齐封接成芯片。


图9-14 集成有光纤和微型雪崩二极管等检测元件的PDMS芯片系统[13]

9.3.3.3 集成发光二极管（LED）和多模光纤的芯片系统
Uchiyama等人通过原位聚合的方法将蓝色的LED直接埋入上层聚酯盖片中，在与LED垂直的下层聚酯芯片的通道侧旁固定一多膜光纤以收集荧光，然后直接导入光电倍增管中检测[14]，如图9-15所示。


图9-15 嵌有LED和多膜光纤的聚酯芯片[14]

参考文献



文章来源：《图解微流控芯片实验室》林炳承、秦建华 著
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