PCR实验小问题③——引物二聚体

莺歌燕舞

我们都知道聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction ，PCR)虽然特异性强、敏感度高，但是它的优点也会放大我们操作过程中的某些小失误，从而导致PCR结果出现各种令人头痛的试验结果，比如非特异性扩增和条带失踪等。这两种结果的可能原因在之前的文章中已经详细介绍过了，今天我们来聊聊出现引物二聚体的可能原因和解决方法！
在体系中添加引物是想要其结合到模板链上，进行目的片段的扩增。但是，有些引物非常“不自觉”！因为其自身或者其他原因，导致引物的3’端在Taq酶的作用下发生了部分碱基互补，并且沿着引物片段继续延伸形成的小片段DNA双链，体现在跑胶结果中就是在几十至一两百bp处出现弥散状条带阴影。我们辛辛苦苦花钱合成的引物，又辛辛苦苦、一丝不苟添加到体系里，怎么能让它浪费在引物间自连这种，即影响结果，又浪费感情的事情上呢！所以我们要减少引物二聚体的出现！都有什么好办法，快来一起看看吧！
①引物自身没设计好。引物设计的不好，自连系数过高会导致引物二聚体的出现，重新设计引物才能从根本上解决问题！
②模板。模板有问题，引物结合不上去；或者体系中模板的量少，浓度低，都会导致引物“没事干”，引物自连的可能性蹭蹭蹭的往上涨！所以要摸索出适合这对引物的最佳体系。
③Taq酶的量太多，Mg2+的浓度过高，体系的扩增性能太好了，引物的自连系数也跟着变高了，所以一个恰当适中的扩增体系是非常必要的。
④在反应结束后应尽快进行琼脂糖凝胶电泳。有的前辈已经试验过了，扩增产物在室温放置时间过长的话Taq酶会将多余的引物合成为二聚体，所以各位小伙伴要合理安排试验时间，尽量将试验一气呵成，耽搁的时间越久，试验结果的变数也就越大。
⑤以扩增产物为模板进行二次PCR，这样可以提高反应的特异性，减少引物二聚体，但是产物因为进行过反复的扩增，导致其浓度非常高，所以使用前可以进行稀释，一般100倍左右即可，但是也要因为产物的浓度进行调整啦！
一千对引物，有一千种实验结果，更可能有不止一千种的意外发生，所以做实验要持之以恒。好的实验态度是成功的一半，那么另一半当然就是可靠的试剂与仪器啦！三狮生物2×Taq PCR Master Mix（Taq酶预混液），科学配比添加了DNA Ploymerase、PCR Buffer及dNTP Mix等多种PCR原料，有含染料与不含染料（电泳时所必需的色素试剂）两种供您选择，您只需要添加模板、上游引物、下游引物和dd水便可进行PCR反应，灵敏度高，特异性强，线性范围广，简单方便。另有普通PCR，荧光定量PCR的全线产品，为您的试验保驾护航！

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