史上最全的30个生物实验技术及原理

空白派

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GST Pull-Down实验

GST Pull-Down实验利用谷胱甘肽巯基转移酶（GST）作为“诱饵蛋白”，将其与靶蛋白融合并固定在谷胱甘肽亲和树脂上。通过使目的蛋白溶液流过此柱子，可捕获与之相互作用的蛋白（即“捕获蛋白”）。随后，通过SDS-PAGE电泳分析洗脱的结合物，以验证两种蛋白间的相互作用或筛选目的蛋白。这种方法简单易行，适用于从细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统或体外转录翻译系统中获取蛋白。
足印法（Footprinting）

足印法是一种用于测定DNA-蛋白质专一性结合的技术。其原理在于，DNA与蛋白质结合后，结合区域的DNA不能被脱氧核糖核酸酶（DNase）分解，从而在检测时形成一段无DNA序列的空白区（即蛋白质结合区）。这种方法能够揭示与蛋白质结合的DNA核苷酸数目及序列，有助于了解DNA与蛋白质之间的相互作用。
染色质免疫共沉淀技术（ChIP）

染色质免疫共沉淀技术是一种研究体内蛋白质与DNA相互作用的方法。该技术通过交联细胞内的DNA与蛋白质，然后利用超声或酶处理将染色质切割为小片段。通过抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。ChIP技术包括细胞固定、染色质断裂、染色质免疫沉淀、交联反应的逆转以及DNA的纯化与鉴定等步骤。该技术不仅可用于检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可用于研究组蛋白的共价修饰及转录因子与基因表达的关系。
基因芯片技术

基因芯片技术是一种高通量的基因检测手段。通过将大量已知序列的DNA探针固定于支持物上，与标记的样品分子进行杂交，可检测每个探针分子的杂交信号强度，从而获取样品分子的数量和序列信息。基因芯片通过将特定序列的DNA片段（基因探针）有规律地排列在硅片、玻片等支持物上，形成一个二维DNA探针阵列。该技术主要用于基因检测工作，通过杂交测序方法，即与已知序列的核酸探针杂交，确定荧光强度最强的探针位置，从而重组出靶核酸的序列。



高效液相色谱（HPLC）技术概览

高效液相色谱（HPLC）是一种先进的色谱分析技术，它融合了经典色谱法与气相色谱理论的优势。在技术上，HPLC采用高压泵输送流动相，并通过特殊方法填充小粒径填料制成高效色谱柱，使得柱效远超经典液相色谱，每米塔板数可达数万至数十万。此外，HPLC配备了高灵敏度的检测器，能够连续检测流出物。
在HPLC系统中，高压泵将贮液罐中的流动相经进样器送入色谱柱，并充满整个系统。当待分离样品进入进样器时，流动相将其带入色谱柱进行分离。分离后的不同组分按先后顺序进入检测器，检测器将信号传输至记录仪，最终得到液相色谱图。这一技术广泛应用于各种化合物的分离与分析。






酵母双杂交
酵母双杂交系统是一种基于酵母遗传分析的实验系统，用于研究反式作用因子之间相互作用对真核基因转录调控的影响。其原理主要基于许多真核生物的转录因子都包含两个相互独立且功能不同的结构域：DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）。
在酵母双杂交系统中，首先需要将两个待测蛋白分别与这两个结构域制成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。具体来说，一个蛋白与BD融合，称为诱饵蛋白（bait），另一个蛋白与AD融合，称为靶蛋白（prey）。当这两个融合蛋白在酵母细胞内共表达时，如果它们之间存在相互作用，就会通过蛋白间的桥梁作用使AD与BD在空间上接近，形成一个完整的转录激活因子。这个转录激活因子能够激活相应的报告基因表达。



噬菌体展示技术

噬菌体展示技术是一种创新的生物技术，它通过将外源蛋白或多肽的DNA序列整合到噬菌体外壳蛋白的结构基因中，使这些外源基因随外壳蛋白的表达而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白能保持其独立的空间结构和生物活性，便于与靶分子进行识别和结合。通过多轮的“吸附-洗脱-扩增”过程，可以高度富集与靶分子特异结合的噬菌体，从而筛选出具有期望结合特性的目标噬菌体。该技术建立了基因型与表现型之间的直接联系，为蛋白质相互作用和药物筛选等领域提供了有力工具。
RNA提取（Trizol法）

Trizol法是一种常用的RNA提取技术，其关键成分包括异硫氰酸胍和苯酚。异硫氰酸胍能够裂解细胞，促使核蛋白体解离，使RNA与蛋白质分离并释放到溶液中。加入氯仿后，氯仿可以抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚则促使RNA进入水相。通过离心处理，可以形成水相层和有机层，其中水相层主要包含RNA，而有机层则主要包含DNA和蛋白质。这种方法简单有效，能够快速、高效地提取出高质量的RNA，为后续的基因表达分析和功能研究提供重要基础。



RT-PCR技术

RT-PCR，即反转录聚合酶链式反应，是将RNA的反转录（RT）与cDNA的PCR扩增相结合的技术。该技术首先利用反转录酶从RNA合成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增，以获得目的片段。RT-PCR实验通常分为两步法进行，每一步都在最佳条件下操作，以确保实验结果的准确性和可靠性。实验步骤包括RNA的提取、反转录合成cDNA、PCR扩增以及产物的电泳和结果测定。
实时荧光定量PCR（Q-PCR）

实时荧光定量PCR是一种利用荧光信号变化实时检测PCR扩增反应中产物量变化的技术。该技术通过设定阈值（通常为循环开始3～15个循环的荧光信号标准偏差的10倍，位于扩增曲线的指数增长期）和测量C%28t%29值（荧光信号到达阈值时所经过的扩增循环次数），结合标准曲线对起始模板进行定量分析。Q-PCR技术具有高度的敏感性和特异性，能够准确、快速地测定样品中的核酸含量，为基因表达分析、病原体检测等领域提供了有力的工具。







BCA法测蛋白质浓度



大肠杆菌感受态细胞（E.coli DH5α）制备

大肠杆菌感受态细胞的制备是基因工程中的关键步骤之一。流程从接种受体菌开始，首先进行过夜培养以确保细菌达到对数生长期。随后，将培养物转接至新鲜培养基中进行二次培养，以进一步增加细菌数量。预冷处理是制备感受态细胞的关键步骤，通过降低温度使细菌细胞壁变得更加脆弱，便于后续处理。离心步骤用于收集细菌细胞，而悬浮步骤则使用特定溶液（如CaCl₂）将细胞重新悬浮，形成可用于转化实验的感受态细胞。这些感受态细胞具有较高的转化效率，能够高效地接纳外源DNA。
质粒DNA的碱变性提取

质粒DNA的碱变性提取是一种基于染色体DNA与质粒DNA在碱性条件下变性与复性差异的方法。在碱性条件下，染色体DNA与细胞内的蛋白质结合并沉淀，而质粒DNA则保持溶解状态。通过调节溶液的pH值，可以实现质粒DNA与染色体DNA的分离。随后，通过离心和纯化步骤，可以获得高纯度的质粒DNA。这种方法适用于大量提取质粒DNA，为后续的实验提供高质量的DNA模板。
目的基因的连接、转化及克隆筛选

目的基因的连接、转化及克隆筛选是基因工程中的核心步骤。首先，通过PCR技术从基因组中分离出目的基因。然后，将目的基因与载体DNA进行连接，形成重组DNA分子。接下来，将重组DNA分子转入大肠杆菌感受态细胞中，利用细胞的复制机制扩增重组DNA。最后，通过筛选阳性重组体，可以获得含有目的基因的克隆。感受态细胞在这一过程中起到了关键作用，它们能够高效地接纳并复制重组DNA，为后续的基因表达和功能研究提供基础。






RNA干扰（RNAi）

RNA干扰（RNAi）是一种通过小双链RNA（siRNA）促使特定mRNA降解来阻断基因表达的技术。siRNA能够与mRNA分子中的互补序列结合，形成双链RNA结构。这种结构被细胞内的RNA酶识别并切割，导致mRNA降解。由于mRNA是蛋白质合成的模板，因此RNAi技术能够特异性地抑制目标基因的表达，为研究基因功能和治疗疾病提供了新的途径。






cDNA末端快速扩增技术（RACE）

cDNA末端快速扩增技术（RACE）是一种基于mRNA反转录和PCR技术的方法，用于扩增基因转录本的未知区域。该方法从已知区域序列出发，利用反转录酶将mRNA反转录为cDNA。然后，通过PCR技术扩增cDNA的未知区域，最终获得完整的mRNA（cDNA）序列。RACE技术适用于研究基因转录本的全长序列和结构，为基因表达和功能研究提供了重要的信息。
mRNA差异显示技术（DD-PCR）

mRNA差异显示技术（DD-PCR）是一种结合mRNA逆转录和PCR技术的方法，用于比较不同细胞或组织中的基因表达谱。该方法首先提取不同细胞或组织中的mRNA，并将其反转录为cDNA。然后，通过PCR技术扩增cDNA，并利用特定的引物和标记方法区分不同细胞或组织中的基因表达差异。DD-PCR技术能够快速分离组织特异性表达基因，为研究基因功能和疾病机制提供了有力的工具。



抑制差减杂交

抑制差减杂交是一种结合抑制性PCR和DNA差减杂交的方法，用于富集差异表达基因。该方法首先提取两种不同细胞或组织中的mRNA，并将其反转录为cDNA。然后，将两种cDNA混合并进行差减杂交，去除共同表达的基因。接下来，利用抑制性PCR扩增差减杂交后的cDNA，进一步富集差异表达基因。这种方法能够消除基因间丰度差异，获得丰度一致的目的基因群体，为研究基因功能和疾病机制提供了更全面的信息。



蛋白质芯片

蛋白质芯片是一种生物技术领域的重要工具，用于高通量地检测和分析蛋白质。该技术将大量蛋白质固定在固体载体上，形成蛋白质阵列。然后，利用特定的探针或抗体与蛋白质芯片上的蛋白质进行反应，通过检测反应信号来分析蛋白质的性质和功能。蛋白质芯片具有高通量、高灵敏度和高特异性的优点，适用于蛋白质组学研究、疾病诊断和药物筛选等领域。
Northern blot与Southern blot

Northern blot和Southern blot是分子生物学研究中的经典技术，分别用于检测RNA和DNA分子中的特定序列。Northern blot利用RNA与DNA探针的杂交反应来检测特定RNA分子的存在和丰度。而Southern blot则利用DNA与DNA探针的杂交反应来检测特定DNA序列的存在和位置。这两种技术具有高度的特异性和灵敏度，为研究基因表达、遗传变异和疾病机制提供了重要的手段。






荧光共振能量转移与双分子荧光技术

荧光共振能量转移（FRET）与双分子荧光技术是基于荧光分子间的相互作用来研究生物分子间距离和相互作用的方法。FRET技术利用两个荧光分子之间的能量转移现象来测量它们之间的距离。当两个荧光分子距离足够近时，一个荧光分子吸收光能后能够将其能量转移给另一个荧光分子，导致后者发出荧光。通过测量荧光强度的变化可以推断出两个荧光分子之间的距离和相互作用。双分子荧光技术则利用两个荧光标记的分子来观察它们之间的相互作用和动态变化。这些技术为研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA等生物分子间的相互作用提供了有力的工具。









酶联免疫吸附测定（ELISA）

酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种免疫测定方法，通过抗原或抗体的固相化及酶标记来实现定性或定量分析。该方法首先将抗原或抗体固定在固体载体上形成固相抗原或抗体。然后，加入待测样品中的抗体或抗原与固相抗原或抗体结合形成复合物。接下来，加入酶标记的抗体或抗原与复合物结合形成酶标复合物。最后，加入底物与酶标复合物反应产生颜色变化或荧光信号，通过测量信号强度可以推断出待测样品中抗原或抗体的含量。ELISA具有高度的特异性和灵敏度，适用于临床诊断、疫苗评估和药物筛选等领域。






双向凝胶电泳（2-DE）

双向凝胶电泳（2-DE）是一种基于蛋白质的等电点和分子量差异在二维平面上分离复杂蛋白混合物中蛋白质的方法。该方法首先根据蛋白质的等电点在第一向进行等电聚焦电泳，将蛋白质分离成不同的区带。然后，将区带转移到第二向进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白质的分子量进一步分离蛋白质。通过双向凝胶电泳可以获得蛋白质的高分辨率图谱，为研究蛋白质的组成、结构和功能提供了重要的信息。
mRNA的分离与纯化（寡聚%28dT%29纤维素柱纯化mRNA）

mRNA的分离与纯化是基因表达和功能研究中的关键步骤之一。利用mRNA 3’末端Poly（A+）尾巴的特点，可以通过寡聚（dT）纤维素柱层析法分离纯化mRNA。该方法利用寡聚（dT）与Poly（A+）尾巴之间的互补结合作用将mRNA吸附到纤维素柱上。然后，通过洗脱步骤将mRNA从纤维素柱上洗脱下来，获得高纯度的mRNA。这种方法适用于从总RNA中分离纯化mRNA，为后续的实验提供高质量的mRNA模板。
His-tag纯化蛋白

His-tag纯化蛋白是一种利用His-tag序列与Ni2+的结合特性在温和条件下纯化目标蛋白的方法。His-tag是一种由6-10个组氨酸残基组成的短肽标签，可以与Ni2+等金属离子形成稳定的络合物。将His-tag融合到目标蛋白的C端或N端后，可以利用Ni2+亲和层析柱将目标蛋白从混合物中分离出来。通过调整洗脱条件可以控制目标蛋白的纯度和回收率。His-tag纯化蛋白方法具有操作简便、纯化效率高和适用范围广的优点，适用于各种表达系统中的目标蛋白纯化。



RNA酶保护试验方法 %28RPA%29

RNA酶保护试验方法（RPA）是一种灵敏的mRNA定量分析方法。该方法利用RNA-RNA杂交体保护目标RNA免受RNA酶消化的原理进行定量分析。首先，将待测样品中的RNA与标记的RNA探针进行杂交反应形成RNA-RNA杂交体。然后，加入RNA酶消化未杂交的RNA分子。由于RNA-RNA杂交体对RNA酶具有保护作用，因此目标RNA得以保留下来。最后，通过测量杂交体的信号强度可以推断出目标RNA的含量。RPA方法具有高度的特异性和灵敏度，适用于研究基因表达水平的变化和疾病机制。
免疫组化

免疫组化是一种组织学和病理学中的重要技术，用于检测和定位组织中的特定抗原或抗体。该技术利用抗原与抗体之间的特异性结合作用，将标记的抗体与组织中的抗原结合形成复合物。然后，通过显微镜观察复合物的存在和分布位置，从而推断出抗原的存在和分布规律。免疫组化方法具有高度的特异性和敏感性，适用于研究组织中的蛋白质表达、细胞分化和疾病机制等方面的问题。
分子标记技术比较

分子标记技术是一类基于DNA序列变异或特定序列的遗传标记方法，包括限制性片段长度多态性%28RFLP%29、随机扩增多态DNA %28RAPD%29、扩增片段长度多态技术%28AFLP%29、SSR（微卫星DNA）和单核苷酸多态性%28SNP%29等。这些技术具有不同的原理和应用范围。RFLP利用限制性内切酶酶切DNA产生的片段长度多态性进行遗传分析；RAPD利用随机引物对DNA进行PCR扩增产生多态性片段；AFLP结合RFLP和RAPD的优点，利用限制性内切酶和特定引物进行扩增；SSR利用微卫星DNA序列的重复次数变异进行遗传分析；SNP则是基于DNA序列中单个核苷酸的变异进行遗传标记。这些分子标记技术为遗传学研究、作物育种和疾病诊断等领域提供了有力的工具。
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