免疫组化常见问题及经验总结（二）

奋斗的小鸟

上期发了漫谈组化的第一期，今天发第二期，继续聊聊免疫组化那些事儿。




                                                               脱蜡复水




为什么脱蜡

• 这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。
  

                                                                        修复

修复

• 由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。
  
• 常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。
  
• 常用修复液：柠檬酸盐修复液(pH值6.0)、EDTA修复液(pH值8.0~9.0)、EGTA修复液(pH值9.0)和Tis修复液(pH值10.0)。抗原修复总体来说PH值越高，修复能力越强；修复不足可能出现假阴性，过度修复会带来背景过深的问题，所以不同组织的修复液选择很重要。
  
• 我们实验室用微波修复中火8min停火8min转中小火7min，效果不错。注意微波修复后自然冷却，不然可能会出现背景色。
  

灭活



灭活内源性过氧化物酶和生物素

• HRP标记或生物素标记的二抗在做免疫组化时，容易受到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。
  
• 内源性的过氧化物酶一般用3%的双氧水封闭10-20min，时间不宜太久，久了容易脱片。
  
• 实践证明以甲醇溶液配制3%过氧化氢效果更好，可能好在保护抗原和固定组织作用。
  
• 在含有丰富的内源性过氧化物酶的组织如肝肾骨髓、胎盘、脾等，由于血细胞中存在大量具有活性的过氧化物酶，这些组织染色可以增加过氧化氢的浓度和孵育的时间，也可以采用碱磷酶标记的方法如APAAP、LSAB等，可以避免过氧化物酶的干扰，提高阳性结果的特异性。
  

封闭




封闭

• 组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；
  
• 封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
  
• 有条件的就用血清封闭，效果肯定优于BSA，没条件的用3%BSA封闭也可以。
  
• 一般室温 10-30min。但也要防止封闭过度，容易造成假阴性。
  

一抗孵育


关于孵育温度、时间

• 一抗孵育温度有几种：4 度、室温、37 度，建议一抗反应在 4 度最佳，低温长时间的反应，结合的最牢固，但时间最好超过 16~24h。
  
• 4°过夜孵育后从冰箱拿出来复温，20-50分钟左右。目的是使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用,4 度和 37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。
  

抗体稀释液和PBS有啥区别

• 体稀释液一般用 PBS 即可，但专用的抗体稀释液中除 PBS成份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA 稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好。
  
• 稀释液的PH值不宜偏酸，会导致背景一片黄（未见特异性染色），建议PH 在 7.4-7.6 浓度是0.01M。（中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）。
  

二抗孵育




二抗孵育

• 二抗一般室温或 37 度 30min-1h，我们实验室是室温50min，冬天适当增加时长。
  
• 荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能会有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。
  
• 二抗种属选择
  
• 二抗种属应与一抗种属相对应，例如：如果你的一抗是小鼠的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗 ，如山羊抗小鼠。
  

DAB显色


DAB

• 背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由 DAB 孵育条件决定。DAB 显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；
  
• DAB 显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；
  
• 若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；
  
• DAB 显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4 度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。
  

染核


染核

• 目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用苏木素复染，注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋白则要短。
  
• 不过这个如果染色不理想可以补救的。方法是：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。盐酸酒精是分化，氨水是返蓝。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蓝即可。
  
• 注意苏木素长时间接触空气会过度氧化，进而失去染色能力，如果出现这种情况，可以更换新的苏木素。
  

脱水封片


脱水封片

• 脱水目的是为了切片能够长期保存，过二甲苯能够使切片透光率增加，切片变得透明，拍出来的效果更好。
  
• 如果切片从乙醇拿出入二甲苯出现乳白色沉淀，是因为脱水不彻底，水不溶于二甲苯导致的。解决办法是更换新的脱水乙醇，从乙醇拿出来后风扇稍微吹干点再入二甲苯。
  
• 二甲苯脱水的一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片胶，然后一手拿住盖片某一端，接近封片胶近端先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一端，这样一般不会产生气泡。如果有气泡，可以按压挤一挤。
  

拍照、扫描




脱水封片

• 拍照倍数
  
• 一般200x即可，但可以低倍套高倍，一张100x一张400x
  
• 全景扫描
  
• 注意选择景深扩展，至少3层，不然会因为焦距不一样，局部会模糊。
  

其他情况




免疫组化实验中的阳性对照和阴性对照。

• 阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；是排除方法和实验系统有无问题；阳性对照做出来了，说明实验步骤和操作是没有问题的。
  
• 阴性对照一般是用 PBS 或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。是排除有无一抗外的非特异性染色。
  
• 阴性对照一定是不会出来阳性结果的，如果阴性对照出来了阳性结果，那一定是非特异性背景染色。
  

切片清洗缓冲液

• 为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我们实验室3次每次5min摇床浸洗。
  
• 注意：①单独冲洗，防止交叉反应造成污染。②温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；
  

产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？

• 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释 抗体来控制。这是最重要的一条
  
• 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。
  
• 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过 延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
  
• 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加 浓度来加强封闭效果；
  
• DAB 孵育时间过长或浓度过高；
  
• PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗/二抗/SP 孵育后的浸洗尤为重要；
  
• 标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。
  

免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？

• 抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结 合；建议微波修复用高火 4 次*6min 试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不行，还 可高压修复。
  
• 抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不知抗体是进口的还是国产的工作液，怎么这 么高稀释度也没能做出阳性结果？另外，不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应 有前带和后带效应，必须摸索最佳浓度。
  
• 组织切片本身这种抗原含量低；
  
• 血清封闭时间过长。
  
• DAB 孵育时间过短。
  
• 细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。
  
• 开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。
  

单克隆抗体和多克隆抗体

• pAb：**polyclonal antibody 多克隆抗体
  
• mAb：**monoclonal antibody 单克隆抗体
  
• 抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。
  
• 单克隆抗体：是指由识别某一个抗原决定簇的浆细胞经过克隆后产生的抗体。
  
• 多克隆抗体：是指有识别多个抗原决定簇的浆细胞经过克隆后产生的抗体。
  
• 因此，单克隆抗体特异性高，灵敏度差；多克隆抗体特异性低，灵敏度高。
  

免疫组化结果如何分析？

• （1）阳性着色细胞计数法。在 40*光镜下，随机选择不重叠的 10 个视野，人工或机器计数阳性 着色细胞，每组 3~6 张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。
  
• （2）灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用imag e j进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。
  
• （3）评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3 分为阴性着色、淡黄色、 浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1~4 分为 0~25%、26~50%、51~75%、76~100%）， 最终可以分数相加，再进行比较。对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、 背景很浅的高质量切片。
  
• 详情可见之前发的一篇推文。
  IHC（免疫组化）结果分析
  

脑组织如何防脱片？

• 脑组织的构成元素主要为胶质细胞，通过神经元连接而成，脑组织细胞中水分和脂质含量较高，在修复过程中会发生脱片碎片。
  
• 首先需要固定充分，固定前把脑子切成几片再固定。
  
• 其次从水中捞出后不要急于平烤，先将水沥干（直立放在切片架上）2小时左右，然后平放于烤片台上烤1时以上。（温度75）。
  
• 最后修复液可以选择温和的柠檬酸钠6.0来修复，过程中不要对着组织直接冲洗。
  

常见封片胶

• 中性树胶，以二甲苯为溶剂，常用来封二甲苯脱水的片子，优点是透明度高，不容易长霉，缺点是二甲苯味儿大。需要特别注意的是，没脱水的片子不要中性树胶封片，二甲苯不溶于水，会生成白色沉淀，影响阅片和扫描。
  
• 水溶性封片胶，最常用的就是甘油明胶，用于免疫荧光等未脱水组织的封片，甘油明胶低温呈固态，
  
• 用之前提前37-50°预热融化。
  
• 抗荧光衰减封片剂，以甘油为基础，加入抗荧光衰减剂，有强烈的 抗荧光衰减作用，用于对荧光组织和细胞样品的封片。缺点是不容易干，盖玻片容易滑动，镜下观察倒还好，全景扫描很受影响。
  
• 解决办法是擦干或风扇吹干多余水分后，100ul枪头滴一滴水溶性封片剂，再用10ul枪头在组织外四周点4点中性树胶，用于固定盖玻片。
  

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