冰切的免疫荧光到底需不需要进行抗原修复？

虎威将军

作为一名病理染色技术方面的老技工，今天跟大家分享一下笔者对免疫染色中抗原修复方法的经验与体会。
相信很多同行会遇到这种问题，qPCR或者转录组测序检测到目的基因明显上调，而免疫荧光或免疫组化却显示目的蛋白为阴性，又或者是石蜡切片能染出目的蛋白而冰切阴性。事实上，这种情况大多数都是由于抗原修复不充分或者没有进行抗原修复。换句话说，进行充分的抗原可修复往往可以改善上述情况。
要讲清楚其中的原理，我们得先说一下切片制备前的取材过程。由于活细胞在缺氧等情况下会启动凋亡或坏死程序，其中伴随溶酶体释放蛋白水解酶的过程，为了减少蛋白降解，我们往往会先对麻醉的动物进行经心灌注后取材。操作是先灌注预冷的PBS或者生理盐水（一是赶走血管腔的红细胞以减少自发荧光效应，二是降低体温而抑制水解酶的活性），再灌注预冷的4%多聚甲醛溶液（交联蛋白保护抗原），再摘取组织器官，接着将组织器官浸泡于不少于组织体积10倍的4%多聚甲醛溶液中进行后固定（不超过24小时），然后才是脱水包埋切片。
上述的4%多聚甲醛溶液之所以能固定蛋白质，是因为醛基作为活性基团，可以交联蛋白质的氨基酸残基，封闭水解酶的结合位点，减少水解酶对其进行水解，从而稳定蛋白质的肽链结构。当然，这个过程也封闭了抗原表位，阻碍了抗原抗体的结合反应，所以，凡是经过了醛类固定剂固定过的组织，在进行免疫反应之前都需要经过充分的抗原修复。以前，更常见的冰冻切片制样前的取材是没有多聚甲醛进行灌注和后固定的，新鲜标本取材，后固定采用丙酮或甲醇。所以，很多同行的传统观念认为，石蜡切片需要抗原修复，而冰冻切片无需抗原修复。其实这是不准确的，具体应该是，没经过醛类固定液处理的组织切片不用进行抗原修复。
抗原修复方法多种多样，有热修复（微波炉和高压锅），酶修复，但目的都是为了解开蛋白的交联，暴露更多抗原表位。抗原修复液也有多种，有酸性的（柠檬酸钠），也有碱性的（EDTA）。一般来说，温度越高，修复液pH越高，修复越彻底。但不是温度和pH越高越好，因为这样也更容易脱片或者切片发生糜烂、碎裂。
顺便提一下关于一个经常被问及的问题：免疫组化或荧光的抗体如何选择？抗体官网如果标明IHC-P，P是石蜡Paraffin的缩写，那么说明这个抗体适用于经过醛类固定剂处理的组织，不管石蜡切片还是冰冻切片，不管是免疫组化还是免疫荧光都可用。如果标明的是IF，则提示说明这个抗体适用于未经过醛类固定剂处理的组织，一般是新鲜冰冻切片，石蜡切片可能不适用。
关于各种抗原修复液和固定液的配制、抗原修复的加热方案，笔者有较为成熟具体经验可借鉴，有需要的可以留言。
分享一下最近帮助同行的故事。


这是个硕士一年级的同行，由于师兄师姐对他的实验技术不信任，叮嘱他不能随便更改实验条件。但是他按照课题组原有的经验总是染不出冰切片子的几个目的蛋白，失败多次后到网上找资料，然后看到了我的经验帖子，感觉似乎有点用，就抱着试试的态度来咨询我。 然后他偷偷改变了实验条件。      
我听了他的经历后，想起我刚上研究生时，为了染血管周细胞的marker，尝试了CST，abcam和R&D多个抗体也无果，后来花了大概半年才找到原因，原来是抗原修复液的问题，最后终于染了出来(本人头像右上图)，并且摸索出了一个非常有效的抗原修复液配方。其中的煎熬我至今难以忘怀。也正是为了让更多同行不用走类似的弯路，后来我用这个配方帮助了很多同个实验室的同学以及网上咨询的同行。
​同样的，我继续用我的配方解救了上述这个同行，只花了一周左右的时间，就把他们课题组历史以来的冰切免疫荧光难题解决了。
为了更好地解决大家的问题，本人已开通微信（_17665739136）在线答疑，可语音或者腾讯会议，付费进行，每30分钟50元。
此外，笔者还有其他科研经验和知识文章分享，请需要的人点击以下链接自取：1、Western blot实验技巧之蛋白样品制备、SDS-PAGE胶制备、跑电泳、转膜、孵育抗体、显影和ImageJ分析（来自一位可稳定重复WB结果的科研狗之四年经验总结）
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