大家做动物组织Western Blot都会做BCA定量吗？

奋斗的小鸟

从去年7年开始，一直在陆陆续续跑动物组织蛋白WB，采用的方法是课题组传下来的：就是先按照一定质量比如30mg，称取动物组织蛋白后，加裂解液，用钢珠研磨后离心取上清，然后蛋白变性后直接等体积上样比如都上5微升，再根据跑出来的actin内参灰度值调整一下上样体积，让内参尽量齐一点。 相当于跳过了BCA定量这一步。 但我觉得相比于细胞提的蛋白，动物组织蛋白真的好难跑，有时候连actin都不稳定，最近跟周围同学交流了，他们跑得好的都会做一下BCA蛋白浓度定量。但诡异的是，我同组师姐她们一直不BCA定量，直接跑了再根据条带调内参，似乎也出了很多结果，条带也还行。 之前我一直想不明白为啥我也用她们传下来的方法，就是WB经常翻车。  不知道知友们跑动物组织WB，都会定量吗？不定量能跑出好看的条带吗？最后，再放几张最近跑的有点辣眼睛的条带，谢谢大家关注~





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卡卡

建议还是用BCA测浓度后再跑。通过灰度统计来反向调整上样体积算是预实验吧，而且每次对不同样品用不同上样体积，在调整的时候会容易出错，大大增加了实验的偶然性，尤其是对做实验不是特别熟练专注力不强的。

感恩由您

什么是蛋白定量？
蛋白定量是蛋白分离和分析前必须的一个重要步骤，蛋白色谱分离、蛋白质电泳分析、蛋白质免疫分离和分析、细胞裂解释放的总蛋白定量、蛋白分子的标记、蛋白结构分析等，都需要可靠的定量分析作为基础。蛋白定量分析应用的领域包括生物科学，食品检验，临床检验等等。
每种蛋白定量方法都有其局限性，而这取决于应用和分析的特定蛋白本身。在选择蛋白定量方法时，需要考虑的特性是：灵敏度(较低的检测限)、与样品中常见物质的相容性(例如，去污剂剂、还原剂、抑制剂、盐和缓冲等)、标准曲线的线性度和蛋白质间的差异。
蛋白定量有哪些方法？
一、比色法
蛋白定量常使用的方法是比色法，通常用于总蛋白的定量分析。根据蛋白和比色试剂的结合，可以将比色法分为：蛋白-染料结合法和蛋白-铜螯合化学试剂法。
前者对应的典型蛋白定量比色法是考马斯亮蓝G250染料结合法，后者则包括双缩脲法，Lowry法，二喹啉甲酸（BCA）法。
1、 Bradford法
Bradford法也称作考马斯亮蓝法，是由Bradford于1976年建立的。该方法的原理是蛋白在酸性条件下和考马斯染料结合，染料的最大吸收值发生改变，从465nm转移为610nm，并且在595nm处有最大的吸收差异。结合到蛋白质分子上的染料数与蛋白所带正电荷成正比，因此可以用该方法来对蛋白进行定量。染料的颜色变化和蛋白中的碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸和组氨酸）有关，另外范德华力和疏水作用也会影响蛋白与染料的结合。




特点：简单便捷、灵敏度高，GBCBIO品牌的蛋白质定量试剂盒（Bradford法），线性标准曲线范围为50-1000 ug/ml，灵敏度25ug/ ml，最低检测蛋白量达到0.5ug。反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量。Bradford 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，如：K+ 、Na+ 、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、EDTA、DTT、TCEP 和β-巯基乙醇等。
需要注意的是：由于高浓度洗涤剂会影响检测结果的可靠性，必须确保样品中的SDS的浓度低于1％，Triton X-100低于0.1％，Tween 20,60,80低于0.06％，以及检测蛋白浓度的考马斯亮蓝和染色PAGE胶的考马斯亮蓝不是同一种物质，前者采用考马斯亮蓝G250，后者采用考马斯亮蓝R250，G250和R250分子基本骨架一样，但是G250多了两个甲基，与蛋白反应迅速，染胶慢且脱色困难，故用于蛋白定量；R250与蛋白反应较缓慢，染胶较快且易于洗脱，故用于PAGE胶染色。
2、 BCA法
BCA (bicinchonininc acid) 1985年Paul K. Smith等人开发出BCA方法，该方法分为两步：首先，在碱性条件下，蛋白将二价铜离子还原为一价铜离子，然后，BCA和一价铜离子结合，形成紫色化合物，该化合物在562nm时有最大吸收，且吸收值与蛋白浓度呈线性相关。




特点：灵敏度高，操作简单，正常情况下可在45分钟内完成测定；且试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳。需要注意的是这种方法需要提前制作标准曲线。GBCBIO品牌定量总蛋白的蛋白质定量试剂盒（BCA法），线性标准曲线范围为50-2000 ug/ml，灵敏度25ug/ ml，最低检测蛋白量达到0.5ug。
实验所需仪器及试剂：恒温水浴锅、可见光分光光度计、离心机、旋涡混合器、试管
操作步骤：
1.标准液制备：梯度稀释牛血清白蛋白（BSA）标准品。将8个EP管按照1到8进行标记，将BSA标准品稀释成1mg/mL工作液，准备浓度梯0，50，100，200，400，600，800，1000 ug/mL。
2.BCA工作液制备：将A液和B液摇晃混匀，按照A:B=50:1的比例配置BCA工作液，充分混匀。（BCA工作液室温下24h内稳定，故现用现配）
3.加样孵育：吸取20μL各个稀释浓度的蛋白质标准品或待测蛋白质样品，加入96孔板底部或试管中，向孔/管中再加入200uL BCA工作液轻轻摇晃混匀。在37°C下孵育30min，冷却至室温。
4.测定：冷却到室温后，以空白为对照，测量样品在562nm或该波长附近的吸光值
5.将各个标准品和待测蛋白质样品在562nm处的吸光值减去空白标准品在562nm处的平均吸光值。
浓度计算：
1.在excel表中输入对应的标准曲线值和蛋白样品值。（图中所示均为举例说明），选定标准曲线的OD值和标准品蛋白浓度。


2.点击excel表栏：插入-图表-XY散点图，并点击确定。


3.点击确定后会自动生成XY散点图，随意点击散点图中的任一的散点，右键添加趋势曲线。


4.点击趋势线的拓展栏，选择“更多选项”


5.选择“更多选项”，弹出“设置趋势图格式”的画面，点击“显示公式（E）”以及“显示R平方值”。一般R2值越接近1，表现标准曲线做得越好，根据标准曲线带入的样品OD值测出的蛋白浓度也越准确，一般要求为0.99几左右。


6.将样品OD值代入标准曲线的公式中，计算即得到待测样品蛋白的浓度。
二、紫外法
紫外法也是常用的蛋白定量方法之一，该方法在简单的分光光度计中就可以定量测定溶液中蛋白质的含量。蛋白质对近紫外光的吸收依赖于酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）含量，同时在很小的程度上也会受到苯丙氨酸（Phe）和二硫键数量的影响。因此，蛋白质之间A280的吸收值相差很大，对于浓度为1 mg/mL的溶液，从0到4的数值都有，大多蛋白的吸收值在0.5 - -1.5的范围之间。
三种方法的优缺点比较




大家可以根据以上介绍，从不同方法的优缺点考虑，选择合适自己的方法，对蛋白进行定量分析。
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捷倍斯生物官网：http://www.gbcbio.cn/
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