大分子蛋白（220kd）wb怎么跑出清晰的条带？

John

样品为乳腺癌细胞，下层胶为8%，转膜条件100v 3h，曝光出来的条带不清晰

原文地址：https://www.zhihu.com/question/508065086

继续前进

最近，小P收到了不少小伙伴关于大分子WB检测的咨询，由此可见大分子检测可谓是难倒一大批做WB的科研人员！
那么作为一家专业的抗体生产商，针对大分子抗体，题主说到的220kD甚至500kD以上的超大分子，Proteintech又是如何检测的呢？


秉承着“助力科研”的理念和愿景，小P带着《Proteintech大分子WB疑难解析和检测方案》来啦~
大分子WB疑难解析

做大分子WB检测，我们首先得弄明白：大分子WB的难点在哪里？只有弄清楚了难点在哪里，我们才能做出相应的对策。
那到底难在哪里呢？难点就在：大分子蛋白质的完整性容易被破坏。
那如何去保护大分子蛋白质的完整性不被破坏呢？我们可以从两个方面去改进：凝胶体系和蛋白样品制备。
（1）凝胶体系

我们目前使用的WB以Laemmli凝胶体系为主，Laemmli凝胶体系的优点我们就不必过多说明，关键是它的缺点大家是否了解？
（a）Laemmli凝胶的分离胶高pH值（8.8）,易造成蛋白质碱性降解，如脱氨基作用等；（b）在Laemmli凝胶体系中含有半胱氨酸的蛋白质的氧化还原状态并不稳定；（c）Laemmli凝胶体系的制样过程中加入SDS sample buffer后，100℃煮样会造成ASP-Pro键断裂①。
由此可见Laemmli凝胶体系对大分子蛋白质完整性的保护是“极不友好”的，所以凝胶体系需要改变。
那到底哪种凝胶体系更加适合大分子WB检测呢？
其实早在十几年前，免疫学的科学家们就提出了Tris-Acetate凝胶体系用于大分子WB的检测，Tris-Acetate凝胶体系的中性pH值（7.0）完美的避开上述Laemmli凝胶体系的缺点，最大程度的保持大分子蛋白质的完整性。
为了验证Tris-Acetate凝胶体系的可靠性，严谨的Proteintech科研人员做了各种实验对比，结果如下图：


通过上述实验结果，可以很清晰地看到，Hela样品在Tris-glycine凝胶中150KDa以上的条带很少且模糊，尤其是250KDa以上基本看不到任何条带；而反观Tris-Acetate凝胶中150KDa以上的条带非常的清晰、锐利。
（2）蛋白样品制备

选择了合适的凝胶体系，接下来的关键步骤就在蛋白样品制备上了。裂解液的裂解强度对大分子蛋白质的完整性起到决定的作用，我们可以通过一张跑胶图片来分析：


上图中是使用三种不同裂解强度的裂解液分别制备的mouse skeletal muscle的总蛋白样品，裂解液强度依次为Lane1（很强） >Lane2（中等）>Lane3（温和）。
我们仔细观察100KDa以上的蛋白条带可以发现在一定范围内裂解液的强度越温和时，100KDa以上的大分子蛋白条带会更多、更清晰。这是为什么呢？
可能存在的原因有：（1）当裂解液越强时，对蛋白质的溶解能力就越强，含量高的蛋白质溶解的就越多，后续对蛋白样品进行定量后，点样相同量的总蛋白时含量低的大分子蛋白质上样量就更低了；（2）当裂解液强时，大分子蛋白质容易被解聚，从而导致条带少。
为了避免大分子蛋白质的完整性在样品制备环节中被破坏，我们可以做以下三点改变：
（1）使用裂解能力温和的裂解液。如RIPA裂解液（中）、RIPA裂解液（弱）、Co-IP裂解液等，对于500KDa以上的大分子蛋白质检测甚至可以使用比上述裂解液更温和的CHAPS裂解液（配方见下文）。当然需要引起我们注意的是裂解液越温和溶解性越差，我们需要结合待测靶蛋白选用合适的裂解液。
（2）使用LDS-PAGE蛋白上样缓冲液。相比于的SDS，LDS不仅具有SDS相同的变性能力，还更加利于维持蛋白质的完整性。
（3）70℃水浴10分钟代替100℃煮样5分钟。70℃水浴可以有效的避免蛋白质ASP-Pro键断裂。
注：以上提供的只是大分子蛋白样品制备的最佳方案，并非常规SDS-PAGE蛋白上样缓冲液制样方式就一定不能用于大分子检测。
大分子WB检测方案

一、样品制备

1. 根据下图配制CHAPS裂解液和LDS-PAGE蛋白上样缓冲液（4X）。


2. 细胞样品处理
a、瓶内裂解法（效果最佳）：适用于所有的贴壁细胞
吸净培养基，用预冷的PBS清洗细胞表面2遍（动作轻柔，防止细胞脱落），尽可能吸取残留的PBS。在冰上按每1000万细胞加入1mL预冷的CHAPS裂解液于细胞瓶、培养板或培养皿中，用移液管吹散贴壁的细胞，对于贴壁紧的细胞也可使用细胞刮收集，收集裂解液，4℃冰箱或冰盒中摇晃30分钟，使其充分裂解。
b、离心法：适用于悬浮细胞和药物处理过的细胞
使用细胞刮收集细胞悬液（连同培养基一起收集），4℃，500 xg离心5分钟，收集沉淀，沉淀用预冷的PBS洗涤两遍，收集细胞沉淀，尽可能吸取残留的PBS。按每1000万细胞加入1mL预冷的CHAPS裂解液，4℃冰箱或冰盒中摇晃30分钟。
3. 动物组织样品：
取新鲜的动物组织，用预冷的PBS洗净组织块上附着的脂肪和血液等杂质，用滤纸吸干水分后称重。在离心管中将组织块剪碎，然后在冰上，按每100mg组织加1mL预冷的CHAPS裂解液。将样品转移到合适大小的预冷玻璃匀浆器中，在冰浴条件下对样品匀浆10-20次至充分裂解，收集匀浆液，4℃冰箱或冰盒中摇晃30分钟，使其充分裂解。
4. 4℃,15000xg离心15分钟，收集上清样品。
5. 使用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度，将样品分装成小份，同时每管按3:1加入LDS-PAGE蛋白上样缓冲液（4X），使样品中LDS-PAGE蛋白上样缓冲液的终浓度为1X，上下颠倒混匀，保存在-80℃冰箱。
6. 使用前室温解冻，每管补加新鲜的2M DTT溶液至终浓度为100mM，混匀，70℃水浴10分钟。
注：（1）不要对样品进行超声破碎；（2）解冻后的样品在2个小时内使用完；（3）样品不要反复冻融。
二、制梯度胶

（1）根据下图配制3M Gel buffer(15X)和40%Gel(37.5:1)。


（2）按配方配制两种不同浓度的Tris-Acetate胶，使用梯度胶灌胶器先灌20mL 3%低浓度的Tris-Acetate胶，然后再将剩余的两种不同浓度的Tris-Acetate胶加入相应的梯度混匀仪杯体中，打开梯度混匀仪杯体的连通阀门开关进行梯度胶灌制，灌至小玻璃上边缘结束灌入，并插入梳子。
（3）室温水平静置2小时，直至醋酸胶完全凝固即可拔出梳子进行跑胶。
Tips：
（1）常用的Tris-glycine胶体系所用的胶母液C%值通常为3，而用于大分子检测的Tris-Acetate胶的胶母液C%值可以适当的降到2.6，这样可以让大分子的蛋白质完全进入凝胶中，避免堵塞在进样口。C%=Bisacrycrylamide/(Bisacrycrylamide+Acrycrylamide)*100%
（2）为让大分子蛋白完全进入凝胶，我们先灌制了2.5-3cm的3%的胶，然后再灌梯度胶。
（3）APS和TEMED应在浇注凝胶之前最后加入。APS溶液应新鲜制备，以确保凝胶具有良好的分辨率。
三、跑胶

1. 根据下图配制1X Running buffer。


2. 将梯度胶玻璃板上的残胶冲洗干净，放置在电泳槽中，加入1×Running buffer，将整个电泳槽放入冰水浴中,将标准品和蛋白样品加入胶的点样孔中，使用130v电压电泳，直至蓝色指示线跑出胶后结束电泳。
Tips：
3-8%的Tris-Acetate梯度胶在冰水浴中使用130v电压电泳通常90分钟指示剂可以完全跑出胶，此时凝胶最下面的Marker为50KDa左右，如需检测200KDa以上的目的带，可以在指示剂完全跑出胶后接着电泳30分钟（即总电泳时长2h），这样最下面的Marker为90KDa左右,200KDa以上的大分子蛋白质会拉的更开。
四、转膜

1. 根据下图配制1X Transfer buffer。


2. 将胶从电泳槽中取出，浸泡在转移缓冲液中，以海绵/滤纸/膜/胶/滤纸/海绵的方式，将其紧密排列，确保各个夹层之间没有气泡，采用20V恒压进行湿法转移过夜，保持整个转移仪在冰水浴中。
Tips：
转膜时不要将凝胶的上部分切掉，因为凝胶的上部分会有分子量较大的蛋白；强烈推荐过夜转移，过夜转移效率最佳。
五、免疫印迹

转移完成后，将膜取出，使用封闭液在37℃水平恒温摇床中封闭1小时，即可用于后续的免疫印迹实验，后续的免疫印迹实验与常规Laemmli凝胶体系步骤相同。
<hr/>好啦，以上就是小P总结跑大分子WB的经验~
一口气看完的小伙伴们有没有？希望看完此篇后，大分子WB检测将不再成为你们的“痛点”！预祝大家实验成功~

如果大家觉得这篇文章能够帮助大家更好地进行实验，麻烦给小P点赞、收藏支持哦！
评论区也是长期开放的，小P会时不时邀请技术支持老师帮忙答疑解惑哦！

最后的最后，针对WB实验的其他“知识点”，欢迎大家查看小P的WB专栏：
WB实验指南当然有想看的主题也可以告诉小P，也可以在各个问题下@ 小P（wink）！

继续前进

如果你研究的蛋白分子量比较大（大于150KD），
苦于一直跑不出好看的western-blot，
那么这篇文章一定适合你！
01 选对凝胶很重要
3种最常见的凝胶包括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate.

• Tris-Glycine凝胶的PH为8.6，且保质期很短。在跑胶的过程中，PH还有上升的趋势，可达到9.5。这会导致蛋白降解和低分辨率。
  
• Bis-Tris凝胶的PH为6.4，相对Tris-Glycine凝胶，稳定性和保质期都有所增加。但这种凝胶需要在溶液中增加抗氧化剂，比如DTT，以维持蛋白的还原性。
  
• Tris-Acetate 凝胶的PH为7，跑大分子蛋白会呈现很高的分辨率。
  
• 所以跑大分子蛋白时，我们推荐使用Tris-Acetate 凝胶！
  

02 凝胶浓度很重要，可使用梯度凝胶
既然选择了Tris-Acetate 凝胶，还有几个要考虑的问题。

• 胖友们知道，凝胶浓度与孔径成反比：浓度越小，孔越大。较大的蛋白质更容易通过较大的孔，所以试剂君建议使用低百分比的凝胶，如7％。
  
• 可以使用梯度凝胶，梯度凝胶非常适合新样本。但是制作梯度凝胶会恨棘手，需要一个梯度凝胶装置，不过现在很多公司都会出售具有不同范围的预倾倒梯度凝胶，大大节省了胖友们的时间。
  

03 提高转移buffer中的SDS，减少甲醇
转移buffer的组成至关重要。如果有甲醇存在，大分子蛋白很容易沉淀。通过减少转移buffer中的甲醇百分比（10％或更低）来避免这种情况发生。为了进一步确保蛋白质不会沉淀，考虑添加SDS至终浓度为0.1％。SDS向蛋白添加均匀的负电荷，使得它们更容易从凝胶转移到膜上。
04 选择合适的膜
膜一般有PVDF膜或NC膜，跑大分子蛋白选择PVDF膜。
如前面所说，如果有甲醇存在，大分子蛋白很容易沉淀。而PVDF膜不需要在转移buffer中添加甲醇，目的蛋白转印的机会更高。

PVDF膜有各种孔径尺寸，最常见的是0.2um和0.45um。与凝胶一样，较大的蛋白比较小的蛋白更容易穿过大孔隙。大多数蛋白质（> 20kDa）可以用0.45um膜转移，避免使用0.2um孔径。
05 增加转印时间
在正确的选择完凝胶、转印膜及转移buffer后，转印正式开始。半干转快且方便，但不适用于大分子蛋白。试剂君建议湿转，因为大分子蛋白转移时间很慢，推荐350-400 mA转移90min或 4°C，40 mA，转印过夜。
但有的大神在实践中验证，接近200 KDa的蛋白（如EGFR），使用半干转的效果也不错。而根据大的说法，像mTOR这种直逼300 KDa的蛋白，只要优化半干转的条件，也照样能做出结果（如按照仪器内置的程序设定转印一次，暂停冷却一段时间，再转印一段时间）。
所以湿转、半干转胖友们结合自己的经验决定，但增加转印时间是必须的~
小贴士
BSA通常作为NC膜的封闭液，但是对于PVDF膜，它的封闭效果并不好。因此，试剂君建议，在封闭PVDF膜时选用0.5%的酪蛋白（Casein）。
具体操作如下：将酪蛋白加入缓冲液中，然后在加热板上加热至80℃或直到溶解；不要煮沸溶液。在使用前冷却至25-40℃。
另外，不要让膜在检测过程中的任何时间点干透，如果膜部分变干，可以让膜完全干掉，然后用甲醇重新润湿，之后用缓冲液浸泡，继续操作。
来源：公众号基因帮

继续前进

个人经验，仅供参考！
1）做220kd蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的，并且在剥胶时要小心，避免损坏。
2）推荐湿装转膜，效果稳定，转移时间需要相应延长，个人经验要3小时以上。
3）转膜液中甲醇含量可适当降低

感恩由您

首先配胶的时候不要浓度太高了，估计分离胶浓度要小于5%；其次，marker要用对；其三，电压小一些；其他的都是WB一般注意事项了，如①二抗不要孵太久；②TBST洗涤时可稍微延长点时间；③电转时放4℃或在里面放置冰盒；④孵抗体时记得用保鲜膜封住等等。

大力水手

SDSPAGE没问题吗，我一般用低电压慢慢跑。我们实验室在做大分子蛋白WB的时候用特殊的transfer buffer： 100mM Tris, 1M glycine, 0.05% SDS. 10V 转膜4h。