wb实验中目的蛋白为什么比预期低?

大v

wb实验中目的蛋白为什么比预期低?
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如果你指的是目的蛋白条带位置比预期低的话，有可能蛋白质有降解，或者分离胶的浓度不合适，胶没有混匀，电泳速度过快。

队长是我

问题过于粗略，说几点潜在的原因：
样本制备： 样本制备是影响Western blot结果的关键因素之一。如果在提取或处理样本的过程中出现问题，如蛋白质丢失、降解或受到污染，可能导致目的蛋白浓度低于预期。
转印过程： 蛋白质从凝胶转移到膜上的过程中可能会出现问题。如果转印条件不正确，如电场强度、时间或缓冲液配方不当，可能会导致蛋白质转移不完全或不均匀，从而影响Western blot信号的强度。
抗体原因： 使用的抗体质量不佳或不适合Western blot条件也可能导致目的蛋白信号较弱。另外，抗体的浓度、稀释倍数以及孵育时间也会影响信号的强度。
蛋白浓度： 如果样本中的目的蛋白浓度很低，可能会导致Western blot结果信号较弱。在这种情况下，可能需要增加加载量或使用浓缩方法来提高目的蛋白的检测灵敏度。
除了以上几点，像温度、pH值、离子浓度等因素都可能影响实验结果，需要进行仔细的优化。
希望以上回答对题主有帮助。
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卡卡

在Western blot（WB）实验中，目的蛋白的表达水平低于预期可能由多种因素导致。以下是一些可能的原因：
蛋白提取问题：如果细胞提取不完全或质量不佳，以及蛋白质提取过程中存在问题，如蛋白降解或浓度测定误差，都可能导致提取的蛋白含量不足，从而影响目的蛋白的表达水平。
抗体问题：WB实验使用抗体来检测目的蛋白。如果抗体存在批次差异、失效或特异性不强等问题，也可能导致目的蛋白的表达水平低于预期。
转录后修饰问题：转录后修饰是指在蛋白翻译完成后对蛋白进行修饰，例如磷酸化、乙酰化等。如果目的蛋白在WB实验前被修饰，则可能导致抗体无法有效识别其表达水平。                                  如果对于结果一直不满意，也可以做一个RPRM靶向蛋白质组学，毕竟WB的定量精度较低，只能是半定量


对蛋白质组学感兴趣的小伙伴们也可以看看这几篇文章：定量蛋白质组学常见问题汇总                一文带你看懂蛋白质组学！看这篇就够了！

检验医师

Western blotting（免疫印迹分析）是一种常用的蛋白质检测技术，用于检测样品中特定蛋白质的存在和定量。WB作为一个最为基础的生命科学检测方法之一，经过长时间摸索与分析，目前已经有了一系列适配性较高的通用WB实验检测方案和流程。但是蛋白质作为一个特异性较强的检测指标，总会有一些并不适用于常规化方法的个体，需要我们对实验步骤进行优化或者修改，才能保证得出一个较为理想的结果。
<hr/>小分子蛋白

小分子蛋白主要指WB检测中小于20kDa的蛋白质，由于分子量小易降解，且带电荷量也相对较少，所以导致其吸附能力比较弱。常用的蛋白WB步骤通常会导致检测结果不稳定，时有时无，甚至出现转膜失败，蛋白弥散等完全看不到目标条带的情况。针对小分子蛋白的WB检测，应该对实验步骤进行优化，以提高结果的准确性。

• 上样
  通常Western Blot每孔上样量为30-50 μg，当蛋白分子量过小时，在跑电泳时容易出现较为严重的弥散情况，上样量建议选择50-100 μg。
  
• 电泳
  配置SDS-PAGE胶时，在高浓度的12%-15%的分离胶中进行电泳，同时加大浓缩胶的比例，使得浓缩胶与分离胶的比例约为4：6，甚至可以5：5，这样可以让小分子蛋白在浓缩胶中充分的浓缩，在后续的分离中减少弥散程度。
  电泳时，以80v电压进行压缩，时间约为40min，电泳至两种胶的界面。然后将电压调整到100v，在12%-15%的分离胶中进行电泳，跑到分离胶一半的位置，一般10kDa的marker能够分开就可以了，目的是避免长时间的电泳使得小分子蛋白弥散。
  

转膜封闭
小分子蛋白由于其分子量小，易降解，吸附能力弱，在转膜时一般使用0.22μm的PVDF膜，在转膜的时候，不要在转膜液中加入SDS，防止小分子蛋白与PVDF膜无法结合，可以将甲醇的浓度提升至30%，增强蛋白与膜的结合性。
小分子蛋白实例详解

• #R30084 IL-8 Rabbit mAb
  

IL-8蛋白（interleukin-8 protein）是一种促炎性细胞因子，大小约为11kDa，通常由许多细胞产生，包括巨噬细胞、内皮细胞和上皮细胞等。IL-8在免疫应答中发挥关键作用，包括诱导中性粒细胞等免疫细胞向炎症部位迁移，并刺激这些细胞的激活。



大分子蛋白

大分子蛋白一般指分子量大于200kDa的蛋白质，由于其分子量大，迁移速度慢，转膜困难等特征，在WB中有时可能难以获得清晰的条带，因为这些蛋白质的迁移和转移可能会受到影响。

• 上样
  在样本制备时适当增加变性时间和温度，确保充分变性和还原，以便大分子蛋白完全展开。同时避免使用过多的样品，以免蛋白聚集导致条带模糊。
  
• 电泳
  大分子蛋白在电泳时，使用6%-8%的分离胶，200kDa以上建议6%进行分离，转膜时胶比较软，注意轻拿轻放，避免凝胶破碎，影响实验结果。
  由于其较慢的迁移速度，建议使用低电压进行电泳。例如，可以选择在80-100V下运行整个凝胶。这有助于防止蛋白过快迁移并避免凝胶过热，同时增加电泳时间，使大蛋白有足够的时间迁移。
  
• 转膜封闭
  大蛋白的转膜通常比较困难，一般使用湿式转移并延长转移时间，保证蛋白活性和充分转膜。常用的转膜条件为80v，根据蛋白的大小，时间通常设定为3h-5h，甚至更久的转膜时间都是可取的。对于200kDa以上的蛋白，建议20v在4℃转膜过夜，可以得到比较好的效果。
  

大分子蛋白实例详解

• #347220 p300 Rabbit pAb
  

p300蛋白是一种重要的转录调节蛋白，大小为300kDa左右，被称为组蛋白乙型丙酮乙酸转移酶，是胞浆酶的一种。p300在细胞核中发挥重要作用，参与许多细胞核过程的调节，包括基因转录、DNA复制、DNA修复以及细胞增殖和分化等。



跨膜蛋白

膜蛋白在高温煮沸时，容易发生聚集现象，形成二聚体或多聚体，聚集后分子量变大，造成后续无法检测到条带或检出的条带位置不对。故膜蛋白样品不宜煮沸，建议根据蛋白具体属性在50-70 ℃ 左右进行热变性。还有一些对热特别敏感的蛋白，对热变性的温度有特殊要求，例如植物样品。植物中对热敏感的蛋白比较多，有的蛋白热变性温度需要与感受态转化温度（42 ℃）一样，过高则检测不到。总而言之，如果样品是膜蛋白，需要根据样品本身情况，谨慎调整热变性的温度，以提高检测效率。对于跨膜蛋白，常用可参考的变性温度是50-70℃ 15min或者 37℃ 30min。
跨膜蛋白实例详解

• # 862212 SLC16A3 Rabbit pAb
  

SLC16A3蛋白是一种单羧酸转运体4（MCT4）蛋白，大小为49kDa左右，它参与乳酸和其他小分子单羧酸物质的跨膜运输。这种蛋白在许多生理过程中发挥作用，包括能量代谢和pH调节。



<hr/>综上所述，成功的实验往往需要前期扎实的背景调研和细致的实验操作，预实验的重要性在于研究人员可以调整蛋白质抽提、电泳、转膜和免疫印迹等步骤，以优化实验条件并确定最适合的抗体浓度和工作条件，以便成功检测目标蛋白质。这有助于确保后续的实验数据得到正确解释，从而对研究结果的准确性和可靠性产生重要影响。

清风寡欲

这类问题建议搜搜各种实验手册，还有一些大公司的基础科研工具说明书，视频