【生物制药】紫外分光光度计蛋白质浓度测定方法

Rose

蛋白质的测定
想必许多人都看过彩虹，既欣赏它缤纷的色彩，又喜欢它的神秘。彩虹是那样的美丽动人，从这一端跨到那一端，犹如花朵编织的环带，缀在天蓝的裙襟上。赤，橙，黄，绿，青，蓝，紫，多么迷人。它把世界上一切柔和的颜色凝固在天空中。仿佛把我们带进了一个童话般的世界，灿烂夺目。彩虹象征着美好，我们的青春、我们的人生都可如彩虹般绚烂多彩。当然，我们觉得枯燥无味的科研实验也可以如彩虹般绚烂。比如蛋白质的测定，就可以通过使用比色法来让它鲜艳起来。


蛋白质是生物体内一种极其重要的高分子有机物，占人体干重的54%。蛋白质主要是由氨基酸组成，因氨基酸排列组合的不同所以有各种类型的蛋白质。生命是物质运动的高级形式，这种运动方式就是通过蛋白质来实现的，所以蛋白质有极其重要的生物学意义。人体的生长、发育、运动、遗传、繁殖等一切生命活动都离不开蛋白质。因此对蛋白质浓度的测定在生命科学和食品等领域都有重大的意义。蛋白质是以氨基酸为基础单位的生物大分子，它的高级结构是由其一级结构决定的，一级结构氨基酸在某些波长下具有光吸收，所以能够使用紫外可见分光光度计通过比色法来对蛋白质的浓度进行测定，分为直接测量法和间接测量法。所谓直接测量，就是通过测定蛋白质在280nm波长下的吸光度来计算蛋白质的浓度，主要原理就是组成蛋白质的氨基酸中，芳香族氨基酸如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在280nm处有吸收。
而间接测量法是因为氨基酸能够与染料结合进而变色，主要有四种方法：Bradford法、Lowry法、Biuret法 和 BCA法。这些方法都是基于相同的原理，就是染料试剂与蛋白质特定的部分进行结合，所测出的吸光度和与蛋白质形成键的染料分子的数量成正比。主要区别在于不同的方法染料的结合位点不同。下面我们就来详细的了解这些方法吧！
Bradford检测法
Bradford检测法是在1976年由Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4倍，可测定微克级别的蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
原理：Bradford法测定生物样品中的蛋白质浓度，考马斯亮蓝G 在游离状态下呈棕色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为蓝色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收，其光吸收值与蛋白质含量成正比。牛血清白蛋白 (BSA) 在该测定中用作蛋白质标准。在 595 nm 波长下测量样品并获得吸光度与标准浓度的线性曲线。使用该曲线，可以确定未知蛋白质样品的浓度。



Bradford检测法

仪器及配件：
•   UV7 分光光度计 (ME-30254726)
•   XP205 分析天平 (ME-11106027)
•   Rainin 移液器
     - 100-1000μL (ME-17011782)
     - 500–5mL (ME-17011790)
•   10 mL玻璃试管
• 一次性1cm比色皿
试剂：
• 蛋白质标准 (BSA) 溶液 (2 mg/ml)
•   Bradford 试剂或考马斯亮蓝 G250
结果：
标准曲线的绘制：





595 nm 处的吸光度与蛋白质标准品的浓度制作标准曲线图

通过标准曲线可知，在UV7上进行Bradford测定时，BSA 标准曲线在高达 1.4mg/mL 时的决定系数R2为0.9991。使用标准曲线自动计算的蛋白质样品浓度满足指定的验收标准，测量结果可重复且符合要求。
Lowry检测法
Lowry检测法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。之后在生物化学领域得到广泛的应用。测定用于量化生物样品中的总蛋白质含量，可测定浓度为5至200μg/ mL范围内的样品。Lowry法需要更多的制样，但与其他蛋白质测定相比，其灵敏度更高。
原理：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin Ciocalteu试剂(磷钼酸/磷钨酸)被蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正相关。Lowry方法需要更多的制样，但与其他蛋白质测定相比，其灵敏度更高。在750nm处测量样品，并根据标准曲线进行定量。
仪器和配件：
•   UV7分光光度计(ME-30254726)
•   CuvetteChanger自动多联池, (ME-30236313)
•   Rainin移液器
    -100-1000 μL (ME-17011782)
    -500-5 mL (ME-17011790)
    -10-100 μL(ME-17011781)
•   10 mL玻璃试管
• 一次性1cm比色皿
• 水浴
试剂：
• 蛋白质标准品(BSA)溶液(1 mg/ ml)
•   2N Folin试剂
• 碱性铜试剂
结果：
标准曲线的绘制：





750 nm 处的吸光度与蛋白质标准品的浓度制作标准曲线图

结果表明在UV7分光光度计上进行Lowry测定时，在200μg/200μL以下时，BSA标准曲线的决定系数R2为0.999，测试的两个蛋白质样品的Srel分别为0.52%和2.82%，这表明测量值有较好重复性，回收率也分别高达100.9%和101.6%。
点击链接了解更多紫外分光光度计相关内容！

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/461369272