干货 | PCR技术原理及步骤

乔帮主

实验原理

Experimental principle
PCR（聚合酶链式反应）是一种在体外快速、大量复制特定DNA片段的技术，其基本原理模拟了细胞内的DNA半保留复制过程。
DNA复制时，以亲代DNA的两条链分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下，按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，组成新的DNA分子，新形成的两个子代DNA与亲代DNA的碱基顺序完全一样。

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01
PCR核心步骤




（PCR扩增原理示意图）
01
变性



PCR循环开始时，将含有模板DNA的反应体系加热至90-96℃（通常为94℃），使DNA双螺旋结构解旋成两条单链，以便后续引物结合。

02
退火




随后降温至45-65℃（典型值为50-60℃或针对特定引物优化的温度），在这个阶段，设计好的一对寡核苷酸引物与模板DNA单链上的互补序列结合。

03
延伸



最后，在72-75℃条件下（通常为72℃），热稳定DNA聚合酶（如Taq酶）从引物的3%27端开始合成新的DNA互补链，沿模板方向进行延伸，生成新的双链DNA分子。【PCR】12月关于举办基因扩增检验技术人员岗位能力培训班的通知
【PCR】12月关于举办基因扩增检验技术人员岗位能力培训班的通知
每个循环结束后，新生成的DNA分子又可以作为下一轮循环的模板，从而实现指数级别的扩增。

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02
PCR实验流程


01
操作细节
试剂准备：包括模板DNA、一对特异性引物、dNTPs（四种脱氧核苷三磷酸）、缓冲液、Taq DNA聚合酶以及灭菌去离子水等。
体系配制：按照一定的比例将上述成分混合到一个离心管中，形成PCR反应体系。
程序设置：根据PCR仪的使用说明，设定好不同的温度和相应保持时间，例如94℃变性、55℃退火（对于具体引物可能不同）、72℃延伸，并重复这些循环数次（通常30-40次）。
扩增后处理：扩增完成后，可进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，或者进一步纯化以用于后续分析。
02
注意事项
无菌操作：PCR实验对污染极其敏感，所有实验材料及操作环境应严格无菌，避免外来DNA污染。
准确量取：PCR反应体系中的各组分用量要精确，尤其是引物和模板DNA的浓度直接影响PCR效率和特异性。
引物设计：引物的设计至关重要，需保证特异性和适当的熔解温度（Tm值）。【有证书！】PCR检验技术人员、生物安全管理、15189内审员、POCT、医疗器械13485/42061内审员培训和质量管理师
防止气溶胶污染：加样、开盖操作应在超净工作台内完成，尽量减少气溶胶扩散的可能性。
仪器校准：确保PCR仪温控准确，过高的变性温度可能导致DNA降解，过低的退火温度或延长的时间则可能导致非特异性扩增。
结果验证：通过电泳检测扩增效果，并确认条带大小与预期目标一致，必要时可通过测序验证PCR产物的准确性。
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