基于CRISPR的诊断技术

John

来源：小桔灯网
CRISPR技术自问世以来，除在基因编辑领域已有诸多应用外，在诊断领域的发展同样迅速。尤其以Cas12和Cas13为代表的单Cas酶反应体系更是获得快速发展。本篇文章主要针对基于CRISPR/Cas技术的不同系统在诊断领域的应用进行介绍。
CRISPR/Cas9诊断系统
在基因编辑领域，CRISPR/Cas9最早被应用，其在诊断领域的开发也有报道。该系统通过把Cas9和PCR进行结合开发了一种针对寨卡病毒分型的特异性检测方法（图1）。


图1 基于Cas9开发的寨卡病毒检测系统
该方法通过sgRNA特异性识别只存在于美国寨卡病毒基因组中的PAM序列，在3小时内对不同亚型进行精确区分。但由于时间长且需要变温反应，该系统在诊断产品开发方向并未广泛应用。
在诊断领域应用中，更青睐利用组成简单、无需变温且检测快速的Cas蛋白上，如Cas12或Cas13。与Cas9不同，这些酶除去能够在识别目标序列后启动靶向切割活性，还具有非特异性切割体系内的DNA或RNA分子的能力（也称为“反式切割”）。在反应体系中加入带有荧光基团的报告分子，利用反式切割活性，使报告分子释放荧光，构成了CRISPR/Cas系统作为诊断技术的基础。
自2016年，基于CRISPR反式切割能力的诊断技术从性能和即时检测可操作性两方面不断改进。产品性能方面主要包括灵敏度、特异性、定量、检测时间、多重检测和抗干扰性。即时检测可操作性方面则以冷链运输、便携性、简易度和应用广度为主。其中以DETECTR诊断系统、SHERLOCK诊断系统、HOLMES诊断系统以及CDetection诊断系统为代表。
SHERLOCK诊断系统
2016年，张锋团队首次阐述了CRISPR/Cas13a系统的功能和机理，即Cas13a与sgRNA复合物特异性识别靶RNA后激活其非特异性降解其他RNA的功能。基于该原理，张锋团队创造了SHERLOCK（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）系统（图2）。该系统首先对靶基因进行扩增（RPA或RT-RPA恒温扩增），再将扩增产物转录为RNA分子，与Cas13a/crRNA特异结合形成复合物，激活Cas13a的反式切割活性，对体系中荧光标记的FQ-ssRNA探针进行切割，发出荧光。该系统展现出的单分子级别的检测灵敏度及单碱基的特异性，是CRISPR-Dx领域中具有里程碑意义的重要工作。


图2 SHERLOCK检测系统
该系统可应用在病原检测、基因型区分、耐药性基因以及肿瘤液体活检的即时检测等领域。以该技术为基础开发的新冠检测产品在2020年5月获得了新冠检测的EUA，成为全球第一个注册获批的CRISPR诊断试剂。


图3 STOP V2系统
但该产品存在两个问题：单靶检测和两步法即扩增与检测之间需要开盖转移；扩增后的核酸易造成气溶胶污染。针对这两个问题，该团队进行了相应的改进，1、推出了SHERLOCK V2：在体系中加入csm蛋白，进一步提高灵敏度，同时根据对不同报告基因的切割偏好性，也加入多种Cas蛋白，实现单次检测多个靶标的目的，并将纸基传感器引入系统，使结果直接用肉眼进行判断。这种可视结果为现场检测提供快捷、简便的实现途径。2、推出了STOP技术（SHERLOCK Testing in One Pot）：该技术直接使用裂解后的样本，且采用AaCas12b酶一步法（边扩增边检测）完成整个检测过程。为进一步提高灵敏度，通过改良提取方式，形成STOP V2系统（图3），即通过加入磁珠富集样本中RNA，提高了起始RNA量。
经临床样本测试，对新冠病毒的检测灵敏度和特异性达到93.1%和98.5%，而RNA富集过程小于15分钟，阳性样本的整个检测时间在30-60分钟即可完成。
DETECTR诊断系统
DETECTR（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter）在2018年由Jennifer Doudna团队研发，是另一种基于CRISPR系统的诊断方法。该方法基于LbCas12a蛋白开发，同样该蛋白具有反式切割活性，不同的是其对单链DNA（ssDNA）有较高的切割活性。当靶标核酸存在时，通过恒温扩增（RPA方法）特定产物，并通过Cas12a和sgRNA复合物进行特异性识别，同时激活Cas12a反式切割活性，将FQ-ssDNA报告探针切割并发出荧光。


图4 DETECTR检测系统
DETECTR系统（图4）从流程上更有优势，不仅步骤上更少，而且所用到的探针为ssDNA探针，合成便宜且保存稳定。经测试和验证，该系统能够从临床样本中快速而准确地检测出与宫颈癌相关的16和18型的HPV，具有高特异性。
同样，在2020年底，基于该系统的新冠诊断试剂获得了EUA。为了应对大规模的筛查，在2022年初，FDA又授予DETECTR BOOST（图5）新冠检测试剂的EUA，这是第一款基于CRISPR的高通量新冠检测产品，将CRISPR与自动化相结合，用于SARS-CoV-2大规模检测。


图5 DETECTR BOOST系统
该系统是一款基于CRISPR的一站式分子诊断系统，能够实现高通量，从样本到结果，具有与PCR相当的性能，且使人工操作时间最小化。
与SHERLOCK相似，为了解决两步法的气溶胶污染以及进一步提高检测灵敏度与特异性，并减少检测时间，该团队在DETECTR的基础上提出了Cas12aVDet。该方法将恒温扩增与基于Cas12a的CRISPR检测整合在一个系统中，将检测时长从2个小时缩短至30分钟内。
上述两个系统是由国外研究团队在诊断方向进行的探索，而在国内同样有优秀的团队在进行研究，比较有代表性的是HOLMES和CDetection系统。
HOLMES诊断系统
几乎与DETECTR系统开发同时，国内王金教授团队同样利用Cas12a的反式切割活性开发了HOLMES（one-hour low-cost multipurpose highly efficient system）系统（图6）。与前两种系统不同的是，HOLMES系统通过PCR步骤实现模板扩增。在此基础上，该团队又做了多种实验，证明了ssDNA和dsDNA靶标都能激活Cas12a的反式切割活性，包括证明了多个物种的Cas12a都有反式切割活性，为后面HOLMES体系中的Cas12a筛选提供了基础。


图6 HOLMES诊断系统
随后，该团队又基于LAMP-Cas12b开发了HOLMES V2系统（图7），并开发了One-Pot一步法CRISPR诊断体系。


图7 HOLMES V2系统
测试数据显示，Cas12b的反式切割活性对ssDNA的亲和力要好于dsDNA，具有更宽的反应温度范围，而且灵敏度与Cas12a相当。
CDetection诊断系统
CDetection是Cas12b-mediated DNA detection的缩写，由中科院周淇院士团队开发的新型CRISPR诊断系统，具有独立知识产权。AaCas12b-sgRNA复合物特异性识别靶标基因后，激活其反式切割活性，高效的切割体系内ssDNA荧光报告分子，从而发出荧光信号。


图8 CDetection的检测灵敏度（以HPV16/18为例）


图9 CDetection 对SNP的检测能力（以肿瘤BRCA1为例）
该系统同样具有极高的灵敏度，可以实现不同病原亚型和SNP的检测（图8、图9）与其他Cas蛋白不同，AaCas12b除拥有较宽的温度范围（25-60℃）外，还具有pH（1-8）的稳定性，能够适应不同环境下的检测条件。
总结
本篇文章我们系统性地回顾了具有代表性的CRISPR/Cas诊断平台，通过汇总发现（表1），各方法应用集中在病原、SNP和肿瘤检测等领域，但各平台所呈现的特点不尽相同，而且中间还经历了从两步法逐渐向一步法过渡的过程。


表1 基于CRISPR/Cas系统的不同诊断平台
虽然该诊断平台起步晚，从发现反式剪切活性到现在才短短6年时间，但随着越来越多Cas蛋白的发现和研究，使得该技术的延展性和潜力巨大。


表2 不同Cas蛋白的特点
基于该诊断平台的分子诊断技术简单、快速，搭载恒温扩增则无需复杂仪器，在近期的新冠疫情中已有注册获批的产品。但该技术仍然有较大的提升空间，比如多重检测性能，以及正在大力开发的免扩增技术，在POCT检测领域具有改变“游戏”规则的潜力，从而为疾病筛查和传染病防控多了一个更加新颖和可行的选择。

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