肿瘤分子检测的十八般武器都有啥？

青草

分子检测：肿瘤抗击战的前哨侦察兵
兵欲善其事，必先利其器。对肿瘤这场漫长的战争中，如果把药物比作是武器弹药，那么引导这些炮弹准确攻击而少误伤正常细胞、监控预后复发等等检测技术就可比作是前哨侦察兵了，或者可以形象地比作是“眼睛”，可见分子检测手段的重要性。不夸张地说，抗癌这场战争将不断受益于分子检测技术的进步。
这篇帖子，我们来对肿瘤分子检测技术做个梳理，对它们的优缺点也做个评述。首先需要明确的是，没有完美的检测技术，只有针对特定情况和特定目的最合适的检测技术。
概述
我们首先从遗传信息的传递法则来看目前的诊断技术，生命科学的中心法则是，DNA用来承载遗传信息，DNA转录成为RNA，RNA再翻译成为蛋白质，我们常见的检测技术，基本上就是检测这三种生物大分子的序列信息、表达水平等。
由于RNA非常不稳定，很容易降解，因此目前对RNA进行检测多数在科研阶段，但检测RNA的好处是发现新的融合基因。总之目前主流的检测技术，基因测序是对DNA信息进行测定，免疫组化等是对蛋白质水平进行测定。



在上图我们可以看到，虽然DNA转录为RNA，再翻译成蛋白质，但是如果没有DNA水平的扩增，也可能存在蛋白质高表达的情况，具体可能的原因很多，这里只是让大家记住一个结论，如果一个药物是靶向肿瘤细胞的蛋白的，如西妥昔单抗，则最好使用组织样本检测EGFR蛋白水平，而不只是通过DNA水平的EGFR扩增判断是否对药物敏感，DNA水平不扩增，蛋白也可能高表达。
免疫组化
免疫组化，是应用免疫学的原理，使用特异性的抗体检测目标组织样本中某一类型蛋白水平的技术，需要注意的是免疫组化检测的只能是组织样本，如果目标蛋白表达量高可以表现出较为深的颗粒性着色。免疫组化技术已经非常成熟，很多蛋白都有特异的商业化抗体。一般对一个肿瘤进行定性，要检测一系列蛋白的表达情况，根据这些来对肿瘤进行定性。



免疫组化检测组织样本中蛋白表达水平
免疫组化的结果解读有几种解读标准：

• 一般而言如果是3个加号（+）认为是强阳性；
  
• 如果是一个加号（+）和一个减号（-）也认为是阴性；
  
• 介于二者之间的两个加号（+）认为是弱阳；
  
• 如果是弱阳性的情况，有时需要再次使用FISH进行验证。
  

免疫组化主要检查组织样本的某些蛋白表达水平，主要用于肿瘤的分型。另外也根据一些蛋白表达量，来判断某些靶向药物的疗效。比如检查Her2的表达来指导曲妥珠单抗，检查EGFR表达来指导西妥昔单抗和帕尼单抗的使用、检查MET高表达来看卡博替尼的使用等。
一般通过检测某些蛋白表达量高低指导的靶向药物比较少，而且某些蛋白表达水平与靶点药物疗效没有确凿性的关系。如血管内皮生长因子（VEGF）的表达量高低，并不能完全与贝伐单抗的疗效一致。血管内皮生长因子受体（VEGFR）的表达量并不能完全判断靶向药物的疗效。很多时候表达量较低，也是可以使用靶向药物的，如阿西替你、阿帕替尼等。
原位免疫荧光杂交FSIH
原位免疫荧光杂交用来判断基因的融合，基因的断裂和重排，另外如存在染色体拷贝数增多也是可以使用FISH的，而且目前而言FISH是一个金标准。



原位免疫荧光杂交技术
FISH的原理是，使用红绿两种荧光探针，分别标记某个基因的两端，如果一个基因的中间没有发生断裂，则红色荧光和绿色荧光靠近，表现的是一种黄色荧光信号，或者红绿两种荧光靠的很近。如果基因发生了断裂，如ALK与EML4基因融合，ALK基因中间断裂，则分别与ALK基因两端结合的红色荧光探针和绿色荧光探针分开，通过计数出现荧光分离的细胞数目，即可判断是否发生了基因断裂。
FISH的检测方法比较成熟，但是操作比较复杂，涉及较多的人工，而且检测一个基因或染色体的重排都在3000元左右。不管是ALK基因的融合，还是脑胶质瘤的1p19q染色体重排，操作流程和价格都是类似的。
一代基因测序技术
一代测序技术出现于上一世纪，是英国科学家sanger发明的，目前仪器和技术比较成熟，特点是一次性可以检测800-1000个碱基的长度，准确度较好，完成一个测序反应的价格在20元左右。
但是缺点是通量低，如果是一次性检测几百个基因，几万个基因，这就该使用二代基因检测技术了，尤其是肿瘤具有异质性的特点，需要一次性对肿瘤组织里提取的DNA进行几千次、上万次的测序，对基因突变频率给出相应的数值，这就是不是一代检测技术可以完成的了，只能使用二代基因检测技术。
但是很多医院里的基因测序仪器都是一代的，主要是仪器价格低，比较成熟和稳定，但是需要知道的是，一代基因检测技术不能检测基因突变频率，而且由于肿瘤存在异质性，所以容易漏检低频的基因突变。



一代基因测序技术（Sanger测序法）
二代基因检测技术
二代基因检测技术也称之为高通量测序技术，主要原理是通过超声波将DNA达成100-200bp的片段，然后通过一定的处理将每一个片段扩增成一个分子簇，再使用相应的技术检测每个分子簇合成一个碱基时释放的荧光信号，或者是电化学信号。可以实现较高的通量，目前较为新的检测技术，可以将人的基因组信息全部测完，价格已经降低为1万元以下。
但是需要注意的是，人的全基因组测序是检测人的正常细胞的DNA序列信息，测序深度一般是30-50乘，而且只做基础的简单的分析，不会进行较为复杂的生物信息学分析。
由于肿瘤具有异质性的特点，对肿瘤组织检测深度只有几十乘是不够的，有时要测几万乘，而且后面涉及到专业的分析和解读。所以这里有个误区，即为什么测一个人的基因组不到1万，检测几十个基因，几百个基因也得几千元，区别是测序深度和后续的生物信息学分析、报告解读。



二代基因检测技术的原理
未来一定是二代基因检测技术的天下，当然目前有一个短板是，对血液里肿瘤细胞裂解释放的DNA检测的灵敏度不是很高，原因是血液里肿瘤细胞裂解释放的DNA浓度很低，只占1%左右，大部分是正常细胞裂解释放的DNA，而且二代基因检测技术还有测序深度越高，出现测序错误的问题，这个并不能通过单独加大测序深度来解决。
吉因加公司的专利技术可对测序错误进行过滤，数据显示是极大地提高了血液检测肿瘤细胞DNA的灵敏度。
PCR的祖祖辈辈
PCR技术也比较常见地用在肿瘤分子诊断领域。经常容易看到的一些EGFR的突变信息是使用QPCR（荧光定量PCR）检测的。我在研究生期间经常摆弄这种仪器，QPCR的结果是一些扩增曲线，通过设置阴性对照，阳性对照来判断是否存在特定的突变位点。
QPCR被称为是第二代PCR技术，第一代PCR是比较传统的PCR扩增技术，这个是获得了诺贝尔奖的一项发明。
ARMS-PCR的全称是突变扩增系统，厦门艾德公司具有一些专利，而且还有一些试剂盒获批对相应的突变基因位点进行检测，ARMS-PCR，比传统的PCR技术灵敏度和特异性会高很多，但其也是只能检测有限基因的已知位点。
ddPCR（微滴式数字PCR）是第三代PCR技术，原理是先将模板分子稀释，然后将每一个模板包裹到一个液滴里面（油包水），而且是每个液体只包裹了一个模板DNA分子，通过反应，液滴的DNA分子被放大了百万倍以上。通过对这些液滴进行检测可知道哪些液滴里有DNA模板分子，哪些里是没有的，进而实现绝对的定量。可以做到极为高的灵敏度和准确度，也就是几万个分子里有一个突变的分子DNA，也可以检测出来。
这种方法比较适合对血液样本的已知基因突变位点进行检测，如EGFR基因的T790M，ALK基因克唑替尼耐药后出现的守门基因突变等，数字PCR的原理还是PCR，检测的是基因的已知突变位点，但是它的极高的灵敏度是特点，比较适合血液样本检测EGFR、ALK的那些二次突变位点，进而知道后续的用药，这里我们也呼吁基因检测公司考虑开发相应的检测产品。



数字PCR的检测原理示意图
总结
如本帖开始所说，没有任何一种检测技术是完美的，也就是既能保证检测的全面，灵敏度有很高，或者未来会有，现在还没有。
下图是几种分子检测技术的灵敏度：

• Sanger（一代测序）的灵敏度是10%，
  
• 二代基因检测技术的灵敏度是2%，
  
• 普通数字PCR的灵敏度是1%，
  
• ArmsPCR的灵敏度在0.1%，
  
• 数字PCR的灵敏度可以达到0.01%或者更低。
  

不同分子检测技术的灵敏度
一般而言，如果有组织样本，自然优先使用二代测序，因为癌细胞就在哪里，肯定可以测到突变信息，而且二代测序技术同时测几十个基因，几百个基因价格已经降低为五六千元，基本上是比较平民化的价格了，由于肿瘤的异质性，以及低频基因突变的存在，最重要的是组织样本很珍贵，用了以后再取就得又让患者受苦，所以最好还是测的全面一些，即使用二代基因检测技术。
对于血液样本，即晚期肿瘤患者，或者不适宜取组织样本的患者。抽血检测肿瘤细胞裂解释放的DNA，这个时候就存在一定的取舍，因为ctDNA的浓度较低，二代检测技术不一定都能测到。
但是ARMS-PCR等技术只能检测有限基因的已知位点，而且对于一些基因突变的位置信息还检测不到（如C797S和T790M是顺式的还是反式的？）所以这个需要综合来考虑，即根据患者的治疗过程，选择合适的检测技术，如果就是只想检测EGFR的T790M，或者ALK的守门基因耐药突变，那就是用ARMS-PCR，或者后面的数字PCR，如果根本不知道是什么导致的耐药，甚至什么基因都不清楚，那就使用二代基因测序。



2016年召开的肺癌会议上，吴一龙教授宣读了液体活检的专家共识，专家共识的要点如下所示：

• 检测已知的、单个临床可药物抑制的靶点，液体活检技术推荐ARMS方法；检测已知的、多个平行临床可药物抑制的靶点，液体活检技术推荐NGS（高通量测序）方法。
  
• 用于发现未知基因，探索疗效监测、预后判断和发现耐药机制等，液体活检技术建议使用NGS。
  
• 液体活检包括循环肿瘤细胞（CTC）和循环肿瘤DNA（ctDNA）可能用于肺癌早期诊断和复发监测，但目前仅限于科研探索。
  
• NGS用于临床研究，需平衡患者利益、伦理要求和科学发现之间的关系，以患者利益为至上。
  

癌度有话说
通过上面的文章我们可以了解到，目前来看，二代测序技术已经是主流的肿瘤分子检测技术，但是它在检测血液样本时需要在灵敏度上做些提升。这也并不只是加大测序深度，或者需要在其他方面做些创新，如吉因加公司的这种对测序错误进行的纠错等。
目前来看，如果是检测特定基因的明确的位点，对灵敏度要求较高，则还是建议使用ARMS-PCR，以及数字PCR。
天下的武器哪一种最好，剑是兵中之王，但是也有缺点，那就是短啊。如果本领不高，遇到个拿长柄大砍刀的也就是悲剧了。或者我们也可以用剑来形容二代检测技术，它是肿瘤分子检测技术里一个威力极大的武器，但是其并不是完美无缺，当然在使用上也需结合患者的治疗状况，检测的目的，与其他检测技术配合。

编者：翱宇
参考文献
1、Diaz and Bardelli. J Clin Oncol, 2014，Feb 20;32(6):579-86.
2、Liang Cheng, et al., Modern Pathology (2012) 25, 347–369.
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