养死了多少细胞，才总结出来这11条干货！（SCI高分大佬推荐）

奋斗的小鸟

细胞培养的路上，有多虐心就有多少需要值得注意的地方。小小的平皿之中，细胞点点，引无数英雄竞挂东南枝。
正所谓“万事开头难”，即便是细胞复苏与保存这两件看似简单的事情，也能造成实验汪内心无比巨大的阴影面积。
好在小编这里有本细胞培养秘籍，可让细胞这个熊孩子彻底变为你的贴心小棉袄。



细胞复苏步骤：



细胞冻存步骤：



其实，刚刚复苏的细胞就像是刚刚出生的baby，非常脆弱，需要各位小伙伴的细心呵护，不然，细胞就会被我们花样养死。为了避免细胞不明不白的挂掉，我们就要对细胞的各种习性了如指掌。
1. 俗语道，到什么山上唱什么歌，不同细胞用不同的培养液。此时，就不得不提起培养基里的“四大金刚”—MEM、DMEM、1640、F-12，它们基本参与了90%以上种类细胞的培养过程。

MEM作为带头大哥，能力非常全面，号称是应用最广泛的细胞培养液。
DMEM作为随时紧跟老大MEM的二弟，青出于蓝而胜于蓝，浓度要高出2~4倍，可分为高糖型（含葡萄糖4500mg/L）和低糖型（含葡萄糖1000mg/L）。
老三1640中规中矩，营养成分比较简单，比DMEM少一点糖和谷光甘肽，常用于淋巴细胞的培养。
小兄弟F12常用来支持CHO、Hela和L－细胞生长以及原代大鼠肝细胞和前列腺上皮细胞的培养。MEM和F12 这两种培养基各取1/2，即可形成神经生物学最通用的培养基。
在此，奉送一个不同细胞系对应的不同培养液的图，供大家参考。





2.  细胞生长的空间密度是细胞培养的关键。具体养细胞时应该摸索细胞喜欢的生长空间密度，即不能让细胞瓶里的细胞因拥挤不堪而萎靡不振；也不能让细胞浓度低于1~5×105个/mL而导致“孤独死”（因为细胞的健康生长需要细胞间的连接）。因而细胞接种前，要先通过细胞计数来调整细胞浓度。
3.  当培养的贴壁细胞形态不好时，可在传代时，先倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清都可以）洗涤一次，用滴管吸走，再加入3ml培养基，沿着瓶底轻轻吹打一遍，然后吸走。这时在正式进行消化、吹打。
其次，把吹打下的细胞悬液加入到含有新培养基的培养瓶内，置于培养箱里培养，按时间点观察细胞贴壁情况（10min,20min,30min）。而后迅速倒出其中的培养基，加入3ml新培养基再轻轻洗一次，然后加入完全培养基培养并观察细胞生长情况以及形态。直至找到细胞完美的形态为止。
4.  至于在培养瓶中加入多少培养基量，则需要实验汪们自己去摸索的。对于生长快的细胞，易生长的细胞加少一点培养基，细胞形态会更好，但是要注意对换液时间的把握。
5.  如何选择培养瓶：一般，生长速度慢的细胞如果想要更漂亮的细胞状态，那么采用塑料瓶会比玻璃瓶的效果好；生长速度快的细胞，用玻璃瓶培养的效果会更好。因此，对于同一种细胞，在其生长速度慢的时候（比如细胞刚复苏时或者原代培养），塑料瓶会好一点；而在其生长旺盛的时候，玻璃瓶则相对会好一点。
6.  细胞冻存时，盖子要拧紧，不然复苏水浴时会渗水，造成细胞污染。因而冻存管要选择原配的管子和盖子（不同牌子、型号的管子会有差别），盖子拧紧后最好用封口膜封住。且每支冻存管都要标上细胞的名称、冻存时间，并记录在册，以免后续复苏细胞时，取错细胞。
7.  细胞冻存时要严格进行梯度降温（-4℃→-20℃~-40℃→-80℃→液氮）。要知道冰火两重天的生活环境只会让娇弱的细胞自爆身亡，谨记：缓降温！但如果真心赶时间时，可用使用细胞冻存盒进行细胞冻存，而后尽快将其转入液氮中。此外，要定期测量液氮罐里的液氮储备，以保证细胞全部浸在液面下。
8.  细胞解冻时，由于冻存管管壁较厚、隔热，而导致水浴时间太长（2min还没融化）时，可以将水浴锅的温度调至40℃左右，可以缩短解冻时间。
9. 提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间，可避免细胞房人满为患，超净台使用紧张，复苏1h后，还没有加入新的培养液。（高浓度DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）
10. 复苏细胞时一定要有耐心，因为有些细胞在复苏一星期后才会真正有起色。因而，尽管细胞在复苏三四天后没有任何动静，也不要轻易倒掉所有细胞，要耐心等待，两周后再做决定。
11.  有关DMSO的一些注意事项：
DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内的离子浓度、减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤程度。
DMSO在溶解过程中会放热，应先与培养基混匀后再加血清，同时冻存液最好提前配置，DMSO现配对细胞的毒性可能更大；
复苏时，要离心去除DMSO，并用新鲜的培养基洗涤1-2次，注意离心的时候速度不要太快。
细胞培养小技巧今天就讲到这里。你可以先把这篇文章保存下来，当你遇到问题的时候再来看也许会更有感觉。
ps：还有什么想了解的关于细胞培养方面的知识都可以在评论区里留言哦~

其实很多时候，我们是不清楚到底是哪方面出现问题的，这个时候就需要一步步去排除可能原因，切勿盲目地一次性改变多个条件。细胞培养是一个不断进步的过程，要想成为达人，看几篇文章哪够？在平时做好积累，量变才会有质变，《细胞培养（第3版）》则全方位介绍了细胞培养的方方面面，实为一本不错实验秘籍。



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