ELISA技术详解：双抗夹心、竞争、间接、直接法的比较与选择

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　　做过ELISA实验人都知道有4种常用方法检测，这4种方法分别是直接法、间接法、竞争法和夹心法。今天通蔚就这四种方法说下他们优缺点。
　　直接ELISA法

　　将抗原直接吸附（或通过捕获抗体结合）到固相载体表面，洗涤除去未结合的抗原及杂质。加入酶标抗体进行孵育，使酶标抗体与固相载体上的抗原结合，形成固相免疫复合物。彻底洗涤除去未结合的酶标抗体。加入底物，酶催化底物反应生成可检测的产物（例如显色或发光产物）。产物的颜色或荧光强度与标本中受检抗原的量成正比，通过测定产物信号即可定量抗原。



直接ELISA法

优点：

　　操作流程简短，实验步骤少；无需使用二抗，减少了非特异性结合的可能性，从而提高了特异性；实验步骤少，操作相对简单，不易出错。
　　缺点：

　　每个抗原分子只能结合一个酶标抗体，信号放大倍数有限，导致灵敏度相对较低；实验中的一抗需要直接用酶标记，成本相对较高；制备酶标抗体的过程比较复杂，而且酶标记可能会影响抗体的活性。
　　间接ELISA法

　　将抗原结合到固相载体上，形成固相抗原。洗涤去除未结合的抗原和杂质。加入特异性的一抗，使其与固相抗原结合，形成固相抗原-抗体复合物。洗涤去除未结合的一抗。加入酶标二抗，该二抗是针对一抗宿主物种的抗体，可以与结合在固相载体上的一抗结合。洗涤去除未结合的酶标二抗。加入底物，酶催化底物反应，生成可检测的产物（例如，产生颜色变化或发光）。通过测定产物的光密度或荧光强度，可以定量样本中抗原的含量。



间接ELISA法

　　优点：

1.信号放大：由于一个一抗分子可以结合多个二抗分子，每个二抗分子又带有酶标记，因此可以显著放大信号，提高检测灵敏度。
2.灵活性高：同一酶标二抗可以用于检测不同抗原，只需要更换相应的一抗即可，无需对每种一抗进行单独的酶标记。
3.保留一抗活性：避免酶标记过程可能对一抗结合能力的影响，更好地保持一抗的免疫反应性。
4.降低成本：无需标记多种一抗，只需要制备或购买一种酶标二抗，从而降低实验成本。
　　缺点：

　　非特异性结合的风险：二抗可能会与样本中某些成分发生非特异性结合，例如类风湿因子或其他抗体，从而导致背景信号升高或假阳性结果。可以通过选择高质量的二抗、优化封闭和洗涤步骤等方法来降低非特异性结合的风险。
　　双抗体夹心ELISA法

　　双抗体夹心法适用于检测二价或多价大分子抗原。首先，将特异性捕获抗体固定在固相载体上。洗涤去除未结合的抗体和杂质。然后加入待测样本，样本中的抗原与捕获抗体结合。洗涤去除未结合的样本成分。接下来，加入酶标检测抗体，该抗体识别抗原上与捕获抗体不同*的表位。洗涤去除未结合的酶标抗体。最后，加入底物，酶催化底物反应，产生可检测的信号（例如颜色变化或发光）。通过测定信号强度可以定量样本中抗原的浓度。
　　抗体夹心法（用于抗体检测）与上述方法类似，但使用抗原包被固相载体并制备酶标抗原，用于检测样本中的抗体，例如IgG



夹心ELISA法

　　优点：

　　高特异性:使用两种抗体识别抗原的不同表位，大大提高了检测的特异性。
　　适用于复杂样品:抗原无需纯化即可进行检测，简化了样品处理步骤。
　　高灵敏度:酶促反应和信号放大策略可以提高检测的灵敏度。
　　多种标记和检测策略:可以根据实验需求选择不同的检测抗体标记方法和信号放大系统。
　　缺点：

1.需要两个不同的表位:待测抗原必须具有至少两个不同的抗原表位，或者多个相同的重复表位，才能被捕获抗体和检测抗体同时识别。这限制了该方法对一些小分子抗原的应用。
2.抗体配对的筛选和优化：需要筛选和优化合适的抗体配对，以确保两种抗体能够同时结合抗原且互不干扰，这可能需要大量的实验工作。
　　竞争法

　　竞争法ELISA用于检测小分子抗原，例如半抗原、激素和药物等。其原理是基于待测抗原与已知量的标记抗原竞争性地与有限量的抗体结合。
　　1.包被/竞争:固相载体上包被的是已知量的抗原或抗体。将待测样本和一定量的酶标抗原（或抗体，取决于具体的实验设计）同时加入反应体系中。待测抗原和酶标抗原竞争性地与包被在固相载体上的抗体（或抗原）结合。
　　2.洗涤:洗去未结合的抗原和抗体。
　　3.检测:加入底物，酶标抗原上结合的酶催化底物反应，产生可检测的信号。关键在于：信号强度与待测抗原的浓度呈负相关。也就是说，待测抗原浓度越高，与酶标抗原竞争结合的抗体就越多，最终检测到的信号就越弱。反之，待测抗原浓度越低，检测到的信号就越强。通过绘制标准曲线，可以根据信号强度计算出待测抗原的浓度。



竞争elisa法

　　优点:

　　适用于小分子抗原的检测:小分子抗原通常只有一个抗原表位，难以使用双抗体夹心法进行检测。竞争法ELISA克服了这一限制，适用于检测各种小分子抗原，例如半抗原、激素、药物、农药残留等。
　　可检测半抗原:竞争法ELISA可以检测半抗原，这些小分子本身无法引发免疫反应，但与载体蛋白结合后可以成为免疫原。
　　对样本纯度要求较低:由于竞争法的原理是基于抗原与抗体的竞争结合，因此对样本的纯度要求相对较低，即使在复杂的样本基质中也能进行检测。
　　可用于检测抗体:竞争法ELISA不仅可以检测抗原，也可以通过竞争性抑制的原理检测抗体。
　　缺点:

　　灵敏度相对较低:相比于双抗体夹心法，竞争法ELISA的灵敏度通常较低。这是因为信号强度与待测抗原浓度呈负相关，低浓度抗原的信号变化可能不容易被检测到。
　　标准曲线范围较窄:竞争法ELISA的标准曲线通常呈S形，线性范围较窄，需要仔细优化实验条件才能获得准确的结果。
　　操作较为复杂:竞争法ELISA的操作步骤相对较为复杂，需要精确控制抗原、抗体和标记物的浓度，以及孵育时间和洗涤条件。
　　容易受到干扰:竞争法ELISA容易受到样本中其他物质的干扰，例如类风湿因子、交叉反应物质等，这些物质可能会影响抗原-抗体结合，导致结果偏差。需要进行适当的质控和验证，以确保结果的可靠性。
　　上述为大家介绍了ELISA的4种常用的检测方法，每种方法都有自己的优缺点，可以结合自己的实验要求和样本类型来选择。

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