体外诊断试剂产品参考区间的界值如何选择？

病理医师

体外诊断试剂产品参考区间的界值如何选择？
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一、参考区间界值选择的重要性




（一）关乎检测结果判定
在体外诊断试剂的临床应用中，其主要是通过对患者样本进行检测，以此来实现对疾病的预测、预防、诊断、治疗监测、预后观察（判断）以及健康状态评价等诸多方面的作用。而产品检测结果到底是正常还是异常，必须要依靠参考区间界值来进行判断。可以说，参考区间界值的选择直接影响着对疾病能否准确诊断、对治疗过程能否有效监测等关键环节。例如，若参考区间界值设置不合理，可能会将本处于健康状态的样本误判为异常，进而导致不必要的进一步检查甚至错误治疗；反之，也可能把存在疾病隐患的样本判定为正常，延误了疾病的及时发现和干预，所以其选择至关重要，是体外诊断试剂不可或缺的关键属性。
（二）影响临床评价指标
正确地选择体外诊断试剂的参考区间界值，能够显著提高临床评价指标满足验收标准的概率。比如在评估试剂的灵敏度和特异性这些关键指标时，如果参考区间界值选择恰当，就能让试剂在检测过程中更精准地识别出阳性和阴性样本，使相关指标达到理想状态，更好地辅助临床决策。但要是界值选择出现偏差，那么极有可能对临床试验结果产生不利影响，导致灵敏度、特异性等指标不能准确反映试剂的真实性能，从而影响整个产品在临床上的应用价值以及可信度，让临床医生无法通过检测结果对患者进行科学合理的医疗决策。
二、参考区间界值选择的总体要求




（一）前提条件保障
生产企业在开展体外诊断试剂参考区间界值相关研究时，要确保有稳固的前提条件作支撑。首先，对于主要原材料必须进行严格的选择与确认，只有质量可靠、性能稳定的原材料，才能为后续试剂的精准性打下基础。同时，生产工艺也不容忽视，经过反复验证、优化的生产工艺，能保障试剂在生产环节的稳定性与一致性。再者，质量管理体系需要得到有效的控制，从原材料采购到产品最终成型的每一个环节，都要有严格的质量把控流程，保证产品质量始终处于稳定状态。只有在这些基础条件都达标的情况下，企业制订的研究方案以及开展的相应研究才更具科学性和可靠性，所确定的参考区间界值也才能更好地反映试剂真实性能，为临床应用提供有力保障。
（二）人员与操作规范
试验人员是体外诊断试剂参考区间界值研究中的关键要素之一。他们需要经过必要且专业的培训，只有这样才能熟悉检测系统的操作程序。例如要清楚如何准确地进行样本制备，掌握不同样本类型所对应的正确处理方式，避免因制备环节出现问题影响最终检测结果。同时，对于校准和质量控制方法也要严格执行，知晓何时、如何对设备进行校准，怎样开展质量控制工作以确保检测数据的准确性。此外，定期对设备进行维护和保养同样重要，像定期清洁、检查仪器部件是否正常运行等，都是保障设备良好工作状态的必要操作，进而确保整个检测过程规范有序，为合理选择参考区间界值提供精准可靠的数据基础。
三、参考区间界值选择的常见方式




（一）建立参考区间
依据《体外诊断试剂参考区间确定注册审查指导原则》要求，所有申报产品均可采用建立参考区间的方式来确定其参考区间。具体操作时，首先要进行参考样本组的选择，制定参考个体的选择标准。在筛选参考个体时，需确定检测项目的适用人群，除成年表观健康人外，像涉及未成年人发育指标、评估衰老相关疾病指标等情况时，也要考虑纳入合适的未成年人、绝经前后表观健康女性个体（比如骨代谢标志物检测）、不同月经周期女性（像性激素检测）等。并且要定义 “表观健康”，评估可能的生理及病理影响因素，据此设定调查问卷，保证问卷填写准确、客观，同时参考个体选择还应考虑如饮酒、妊娠或哺乳期、血压异常、肥胖、近期或既往疾病等诸多排除因素，申请人应根据检测项目的不同，合理增加或减少排除标准。
接着要制定参考个体的分组标准，根据所筛选参考个体的特征，考虑其是否对临床决策有意义，从采样时间、地理位置、职业等因素来进行分组。参考个体选择时，应按照明确的标准采用直接抽样的方式，适用时建议通过多中心招募的形式纳入参考人群。
样本采集与处理环节也很关键，要确保参考个体的状态良好，因为像样本采集前进食、药物戒断、生物节奏、采样时间、身体活动、压力、采样前的休息时期等个体状态因素，以及采样环境、采样时间、采样体位、样本类型、运送方式、样本状态、样本分离、储存方式等都会对参考样本采集、处理和储存产生影响。申请人应采用符合说明书声称要求的样本进行参考区间研究，并在研究报告中详细说明样本类型、储存方式等情况，例如检测采用血液样本，要区分动脉血、静脉血及毛细血管血，如需使用抗凝剂，需明确抗凝剂的类型；采集尿液样本应明确取样时间段（如适用）等。
之后要用检测系统（包括样本处理用产品、检测试剂、校准品、质控品、检测设备等）进行参考样本的检测。
完成检测后就是数据分析，依据临床意义的不同，参考区间研究需要确定检测项目的 2.5% - 97.5% 人群分布（对应 95% 参考区间）等情况。参考样本数量方面，通常采用 90% 置信区间估计参考区间时，需要 120 例参考样本，若不足则需补足相应参考样本例数。还要绘制分布图来了解数据分布特征，并对数据进行审查，判断数据对称性和正态峰，可通过直方图、正态概率图，或采用假设检验的方法（如 WKS 检验法等）进行综合判断。对于数据离群值的判定，申请人应采用合理的统计分析方法，比如 Dixon 方法适用于非正态分布数据，通常利用比值 D/R≥1/3 来判断离群值；Tukey 法用于正态分布数据，通常取四分位间距上下限 [Q3 + 1.5×IQR，Q1 – 1.5×IQR] 来判断其离群值，且确定的离群值要有明确原因才可剔除，如无明确原因，应将该数据保留。
（二）验证原始参考区间
当申报产品同时满足以下条件时，可采用验证原始参考区间的方法确定其参考区间。其一，原始参考区间的研究应系统全面，具有可信性，比如已发布实施的临床检测参考区间标准等。其二，检测系统需具有可比性。其三，参考区间研究的分析前因素需具有可比性，像参考个体的状态，标本采集和处理程序等。其四，参考人群具有适宜性，即原始参考区间研究所采用的参考人群应在人群分布的地理位置、人口统计学特征等方面与申报试剂预期适用人群相一致，或包含符合参考区间建立参考样本数量要求的上述参考人群。不过考虑到国内业界公认参考区间如卫生行业标准中明确的参考区间，其建立时均采用了广泛适宜的参考人群、规范的分析前因素等，所以申报产品在选择这类参考区间进行验证前，可不再考虑第三和第四条。采用验证原始参考区间的方法时，重点在于对已有参考区间在自身产品及适用人群等条件下进行验证，确保其适用性和准确性，以此来确定是否可以采用该原始参考区间用于产品的参考区间设定。
四、不同类型试剂的界值选择要点




（一）定性检测试剂
对于定性检测试剂来说，常采用受试者工作特征曲线（ROC）的方法来确定阳性判断值，这其中有诸多要点需要关注。
首先，样本来源要具有代表性，应选取该检测项目结果应用的目标人群作为样本来源。比如在检测某种传染病的定性检测试剂中，要涵盖不同地域、不同年龄段、不同感染阶段等可能影响检测结果的因素下的人群样本，确保能反映出实际应用场景中各类人群的真实情况。而且，在判定样本阴阳性时，需要参照可靠的临床诊断信息或者对比方法的检测结果来进行。同时建议纳入阴阳性比例相似的样本开展研究，并非是选取反映实际发病率的样本，因为我们重点关注的是试剂区分阴阳性的能力。
此外，在实际应用中，不能仅仅考虑检测结果与诊断结果的一致性，还需要深入研究其与临床进程的相关性。比如某种肿瘤标志物的定性检测试剂，不仅要能准确判断当下样本是阳性还是阴性，还得考量阳性结果与肿瘤发展阶段、预后情况等临床进程之间的关联。
还有很重要的一点，建议申请人从临床意义的角度出发，合理设定灰区范围，并详细说明确定这一范围的依据。例如，对于部分处于临界状态的检测结果，明确其属于灰区后，也要清楚地制定后续处理措施，像是进行复测后确认或者采用其他试剂进一步确认等，以此来保证检测结果的准确性以及对后续临床决策的有效指导。
（二）定量检测试剂
定量检测试剂在确定参考区间时，需依据数据分布形式来选择合适的统计方法，主要分为非参数统计法和参数统计法。
在建立参考区间方面，通常要使用至少 120 个来自目标人群的受试者样本，采用非参数统计方法（如适用，包括 90% 或 95% 置信区间）来建立参考区间。在此过程中，建议基于严格的人群入选标准，排除检测项目潜在异常的人群，尽量入选健康正常人的样本。例如在进行某项血液生化指标的定量检测试剂参考区间建立时，通过调查问卷等方式，排除近期服用特定影响检测药物、患有相关疾病等可能干扰检测结果的人群，确保入选样本的健康状况符合要求，从而让建立的参考区间更具科学性和可靠性。
而当实验室、分析系统（方法和仪器）、地理区域或人群存在一个变量的情况下，可以考虑转移分析物的参考区间。转移参考区间时，需使用至少 20 个受试者样本进行评价，若在评价过程中发现多于 2 个样本超出参考区间范围，那么就需要纳入更多的样本进行验证。若经过验证确实无法转移参考区间，那就建议重新建立参考区间，以保障其能准确适用于相应的检测场景和目标人群。
五、样本相关考量因素




（一）样本选择与分组
在体外诊断试剂参考区间界值研究中，样本的选择与分组是至关重要的基础环节。首先要精心选择合适的样本，制定科学合理的纳入和排除标准。比如对于不同的检测项目，适用人群是有差异的，除了常见的成年表观健康人外，如果涉及像评估未成年人发育指标，那就要考虑纳入合适的未成年人；要是检测项目与衰老相关疾病指标有关，老年人也应作为参考个体纳入；对于部分女性相关肿瘤标志物、骨代谢标志物等检测，绝经前和绝经后表观健康女性个体就需要被考虑进来；还有像性激素检测，不同月经周期女性也应在选择范围内。
同时，要依据申报产品的特性个性化定义 “表观健康”，全面评估可能的生理及病理影响因素，进而设定调查问卷，并且采取有效措施保证问卷填写的准确、客观。像脂蛋白相关磷脂酶 A2 测定试剂盒，纳入排除标准中应排除无动脉粥样硬化的患者；雄烯二酮测定试剂盒要明确是否排除遗传性肾上腺皮质增生、肾上腺皮质功能减退等疾病人群；D - 二聚体测定试剂盒的排除标准应考虑产品宣称的 “弥散性血管内凝血及溶栓治疗” 适应证；叶酸（Folate）测定试剂盒是否排除巨幼红细胞性贫血人群等，这些都是根据不同试剂盒特点制定纳排标准的体现。
在样本分组方面，要根据所筛选参考个体的特征，从是否对临床决策有意义的角度出发，选择诸如采样时间、地理位置、职业、年龄、性别、血型、种族、昼夜节律、饮食、吸烟、运动、月经周期、妊娠阶段等因素来进行合理分组。参考个体选择时，应按照明确的标准采用直接抽样的方式，尽可能让参考个体接近检测项目的临床患者分布组成，涵盖各年龄组内不同年龄段，且男女个体数量相当（适用时），地域选择也要具有代表性，建议通过多中心招募的形式纳入参考人群，以此确保参考人群分布科学合理，为后续准确确定参考区间界值筑牢根基。
（二）样本采集与处理
样本采集与处理环节同样不容忽视。采集前，要充分考虑参考个体的状态，因为个体的很多状态因素都会对检测结果产生影响，例如样本采集前进食会对许多检测项目有直接（浓度改变）或间接（脂类物质干扰）的影响，长期节食也会造成许多检测指标改变，另外，咖啡因、酒精、香烟和维生素 C 等，同样会干扰检测结果。所以要对参考个体各项可能产生影响的因素进行细致评价，只有保证个体状态良好，方可进行样本的采集。
在采集过程中，明确样本来源、类型以及储存方式等十分关键。就拿常见的血液、尿液样本来说，血液样本采集时，要区分是动脉血、静脉血还是毛细血管血，如果需要使用抗凝剂，必须明确抗凝剂的类型；像醛固酮测定试剂盒，还需补充仰卧位、直立位样本的采集方法，且由于该项目与生理节律有关，还应明确采血时间，并相应在说明书中列明。而采集尿液样本时，则要明确取样时间段（如适用），也要说明是否添加防腐剂等情况，例如尿转铁蛋白测定试剂盒在采集时就需要明确这些要点。总之，规范的样本采集与处理流程，是保障体外诊断试剂参考区间界值研究准确性的重要环节。
六、数据分析中的关键环节




（一）确定样本数量
在体外诊断试剂参考区间的数据分析中，样本数量的确定至关重要，需要依据相关标准来执行。通常情况下，若采用 90% 置信区间估计参考区间时，按照《体外诊断试剂参考区间确定注册审查指导原则》要求，需要研究至少 120 例样本；要是置信区间为 95%，则需研究至少 146 例样本；而置信区间为 99% 时，需研究至少 210 例样本。比如部分试剂盒在进行参考区间研究时，像孕酮测定试剂盒应根据孕周的大小对其参考区间进行分组，若采用 90% 的置信区间，那么每组就应采用至少 120 例样本进行研究。
同时，针对不同的人群，样本数量要求也会有所不同。对于新生儿、幼儿、老年人等样本难以获得的人群，可以少于 120 例样本，但也要在满足科学性和统计学要求的前提下合理确定数量，以此保障参考区间界值选择的可靠性，为后续准确判断检测结果是否正常提供扎实的数据基础。
（二）绘制分布图及判断离群值
绘制分布图是了解数据分布特性的重要手段。我们可以通过绘制直方图、正态概率图，或采用假设检验的方法（如 WKS 检验法等）来直观地判断数据是否呈正态分布，也就是对数据对称性和正态峰进行分析。例如糖化血红蛋白测定试剂盒就需要补充各研究数据属于正态分布的统计分析过程等，通过这样的分析，能帮助我们掌握数据的整体特征，进而为后续选择合适的分析方法做准备。
而在判断离群值方面，推荐使用 Dixon 方法和 Tukey 法这两种方法。Dixon 法适用于非正态分布数据，通常利用比值 D/R≥1/3 来判断离群值；Tukey 法用于正态分布数据，一般取四分位间距上下限 [Q3 + 1.5×IQR，Q1 – 1.5×IQR] 来判断其离群值。需要注意的是，不管使用哪种方法确定的离群值，都要有明确原因才可剔除，如果没有明确原因，那就应该将该数据保留，以保证数据的完整性和分析结果的准确性。像在一些实际的检测项目中，如果发现疑似离群值，就需要严格按照上述规则去判定和处理，避免随意舍弃数据而导致结果出现偏差。
（三）分组比较参考区间
分组比较参考区间要遵循一定的准则，通常需要根据是否对临床决策有意义或者是否具有明确的生理学意义来进行分组。比如脂蛋白相关磷脂酶 A2 测定试剂盒的参考区间与年龄有高度相关性，那就应确保每个年龄段有一定的样本量，并分别进行统计分析。
同时，还要结合数据的分布特征来选择合适的分析方法。如果数据呈正态分布，且是两组间进行比较时，申请人可采用 Z 检验；要是多组间比较，则可采用 F 检验等。并且，对于那些不存在统计学意义的组间，可以合并参考区间，以此来优化参考区间界值的选择，使其更贴合实际临床应用场景，更有助于准确地通过体外诊断试剂的检测结果判断样本的状态。

大力水手

一般来说，都会采用95%的置信区间，然后根据产品本身的临床意义，可以使用单侧95%或者双侧95%置信区间。
当然，也可以根据产品自身的特点进行调整。