多重PCR技术解析与分享

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多重PCR (Multiplex polymerase chain reaction，MPCR) 是指通过一次 PCR 反应同时对多个靶标进行扩增，结合一定的检测手段对扩增产物进行检测从而实现对多个靶标进行诊断的技术。多重PCR具有高效率、高通量、低成本的特性而被深入研究，并且被广泛应用于科学研究和疾病诊断等领域。


1988年Chamberlain首次提出多重 PCR的概念，由于多重PCR具有高效率、高通量、低成本的特性，因此在诸多领域都有多重 PCR的应用，例如基因突变与缺失、基因分型与定量、遗传检测、耐药诊断等。并且，随着生物技术的发展，多重PCR技术在扩增和检测方面已经取得了许多新的突破。在扩增方面，不再局限于在同一反应管中进行扩增，而是将不同的引物对和模板分散于相对独立的空间中进行扩增；在检测方面，不断有新的超多重检测技术的出现。本文将分别从检测和扩增两方面介绍现有的多重 PCR 技术的优点及存在的问题。


一、多重荧光定量 PCR 技术
多重荧光定量PCR (Multiple fluorescencequantitative PCR)技术是在荧光定量 PCR 技术的基础上，利用几种不同荧光基团的组合，结合仪器对不同通道荧光的检测能力实现对多个靶标的实时定量检测。
1、基于荧光探针的多重 PCR 技术
TaqMan水解探针 (Hydrolysisprobes) 是多重荧光 PCR 体系中常用的一种探针，探针一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团，通过在不同序列末端标记不同荧光基团及相应的淬灭基团，即可形成不同的 TaqMan 水解探针，将上述探针及相应的扩增引物加至同一反应体系，即可实现对多个靶标的共同检测。


分子信标 (Molecular beacon) 是多重 PCR 体系中另一种常用的探针，基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET) 的原理，当体系中不存在特异性的靶标时，分子信标会自发形成茎环结构，淬灭基团与荧光基团相互接近从而发生 FRET，不会产生荧光。如果体系中存在特异性的靶标，在一定的条件下，茎环结构会打开并且与靶标进行复性，从而产生荧光信号。那么在同一个反应体系中加入几种靶标特异性的分子信标就能够实现对多个靶标的同时检测。


基于水解探针和分子信标探针的多重荧光定量 PCR 技术的优点是简便快捷，然而受仪器荧光检测通道的限制，往往最多只能达到四重或五重检测。
2、基于探针编码的多重 PCR 技术
组合探针编码 (Combination probecoding) 技术的开发，使得目前的多重实时核酸扩增可检测的靶标数目多于仪器可检测的数目。通过对 4 种不同的荧光基团进行相互组合可以形成15 种指示探针，在多重反应体系中加入多种靶序列特异的置换探针 (Displacing probes)，那么在检测通道有限的情况下仍能够实现对多种不同的靶标同时进行扩增和检测。


3、基于荧光染料的多重 PCR 技术
非特异性的荧光染料嵌入到 DNA 双链小沟中后，在特定的激发光激发后将会产生一定波长的荧光。以此为基础发展了熔解曲线 (Meltingcurve) 分析法，利用不同 DNA 序列具有不同 Tm(Melting temperature) 值的特征，在 PCR 反应结束后，通过程序升温使双链逐渐解链成单链，当达到双链特异的 Tm 值所对应的温度时，荧光强度大幅度降低，利用这样的原理可以对 PCR 中不同长度的双链产物或相同长度不同 GC 含量的双链进行分析。被广泛用于病原体分型检测，针对不同的型别设计了特异性的引物对，从而对模板进行扩增生成不同的扩增子，扩增子之间T m 值各有差异，最后通过熔解曲线峰的位置进行鉴别。
后续在熔解曲线分析技术的基础上又发展出高分辨率熔解曲线技术，一种利用饱和染料，借助高分辨率的仪器，实现对单个核苷酸熔解温度不同从而形成不同形态熔解曲线，进而对基因进行分析的新技术，它具有极高的灵敏度，能够检测出单个碱基之间的差别，目前主要应用于单核苷酸多态性分析、甲基化分析、基因突变、基因分型等领域。
基于荧光染料的多重 PCR 技术由于染料不具备特异性的识别能力，所以缺点在于同一反应体系中通常只能使用一种荧光染料。


4、基于荧光探针熔解曲线的多重 PCR 技术
由于荧光基团本身发射的不是单一波长的荧光，而且 PCR 仪对不同荧光基团发射的荧光信号的区分度有限，所以现有的 PCR 仪只能检测 4–5 种不同的荧光信号。而基于荧光染料的多重 PCR 技术由于染料不具备特异性的识别能力，所以同一反应体系中通常只能使用一种荧光染料。为了弥补这两种方法的不足而开发出来的荧光探针熔解曲线技术 (Fluorescence probe melting curve technique)具有成本低、多重检测能力更强的优点。


通过在靶序列中选取相对保守的区域设计通用扩增引物，然后在引物对之间选取差异度较大的区域设计能够识别各种目标核酸序列的特异性探针，探针在扩增的过程中不会被完全水解，并且根据检测通道的不同将探针进行分组，每个通道中包含多个特异性探针，通过调整探针的长度或GC含量对每条探针的Tm值进行人为的调控，使得同一检测通道内针对不同靶标的检测探针T m值都间隔合适的差值，每个荧光通道均可定性检测多个靶标，最后通过熔解曲线进行分析。
二、基于微流控的多重 PCR 技术
1、基于微流控芯片的多重 PCR 技术
基于微流控芯片 (Microfluidic chip)的多重PCR 技术通过在芯片微孔中预装填不同的引物对的方法将各重扩增限制在各自的独立空间内，再通过液流控制系统将模板引流到不同的微孔中，进而在微孔中进行特异的 PCR 扩增反应，最后再进行终点定性检测，从而实现对多个靶标的区分和鉴别。


基于微流控芯片的多重 PCR 技术的优点是在一定程度上避免了非特异性扩增产物的生成以及在荧光定量PCR的基础上增加了检测重数。但是当模板浓度较低时，基于微流控的方法将模板分流至含特异性引物微孔中的概率降低，易产生假阴性结果；
2、基于微流控的多重液滴式数字PCR技术
基于微流控的多重液滴式数字PCR的作用原理与基于微流控芯片的多重PCR 的原理相似，通过芯片装置和液流控制系统产生成千上万个液滴，每个液滴中只包含单个目的 DNA 分子，这样就可以使不同的靶标处于相对独立的空间进行各自特异性的扩增反应，最后通过计算各靶标发生有效扩增的液滴数，从而实现绝对定量。


多重液滴式数字 PCR 的优点同样是在一定程度上避免了非特异性扩增产物的生成以及在荧光定量PCR的基础上增加了检测重数。缺点在于当模板浓度较低时，基于微流控的方法将模板分流至含特异性引物微孔中的概率降低，易产生假阴性结果。此外，多重液滴式数字PCR的技术，通常会在一个液滴中包含多对引物或者液滴中的引物与模板为非特异性配对，另外它对模板的要求较高，浓度过高的模板不能保证生成的每个液滴中仅包含单个目的 DNA 分子。
此外在检测方面，上述两种技术都需要配合扩增的特殊性而使用到高精密度的检测仪器，其技术的复杂性使其实现较为困难。

三、基于固相载体的多重 PCR 技术
1、基于膜层析的多重检测技术
膜层析技术 (Membrane chromatography) 是在柱层析技术上发展而来的一项技术，以膜介质为基质，偶联相应的离子交换、亲和、疏水等化学基团，制作而成的一种新型的层析介质。膜层析技术具有简单快速并且能够自动分离液体混合物的优点，而多重 PCR 技术具有有效富集目的片段的优点，将这两种技术有机地结合在一起能够形成一种灵敏度高、特异性好、成本低、简便快速的多重核酸检测方法。
该方法提前将靶标特异性的捕获探针固定在层析膜的不同位置上，然后使变性后的多重PCR扩增产物通过毛细作用经过层析膜，固定在特定位置的捕获探针通过碱基互补配对的作用将末端带有胶体金或荧光素的产物捕获，而非特异的扩增产物及引物被洗脱，最后通过肉眼或荧光检测仪对产生的荧光进行检测和识别。


基于膜层析的多重检测技术以其操作简单、携带便捷等优点拓宽了可检测的范围，使检测不再局限于实验室，对于现场检测也能够实现，但是膜层析技术中样品的阻滞、非特异性杂交等问题仍然是今后需要解决的问题。
2、基于 Luminex 液相芯片的多重检测技术
液相芯片技术 (Liquid chip technology) 被称为后基因组时代的芯片技术，也被称为 xMAP 技术。它可以同时对1份标本中的100种不同目的分子进行检测，并能在半小时内检测96个不同的样本。
其液相微球编码原理为，将两种荧光染料分别用 10 种不同的浓度两两混合形成 10×10的荧光配比阵列，并对微球进行染色，得到 100 种不同荧光编码的微球。将荧光编码且共价结合了不同捕获探针的微球悬浮于一个液相体系中，先加入待检测分子与其反应，再加入带有荧光标记的报告分子，从而形成“微球-捕获探针-靶标-报告分子”复合物。
检测时，该复合物在鞘液的作用下将逐个通过检测通道，接受两束不同波长的激发光照射并对相应的发射光进行检测，其中一束激光用于识别微球种类，即判定该种微球是对哪种特定的靶标进行检测，另一束激光用于检测微球上报告分子的荧光强度，从而实现对待测物质的定性和定量分析。
虽然基于Luminex 液相芯片技术能够实现同时对多种不同病原体的检测和鉴别，但它仅在检测方面发挥了其多通量、高效率的特性，其实质上并没有解决多重扩增中众多引物、探针、模板间相互错配的问题。因此，未来开发出微球表面多重扩增以及Luminex 液相芯片检测一体化的技术是核酸多重检测的重要研究方向。



总结与展望
多重PCR技术的优势在于它的高效性，通过一次扩增反应即可实现对多种病原体进行检测和鉴别，相较多个单重检测而言成本显著降低。具有广泛的应用前景，但是仍然存在许多影响多重PCR扩增与检测效果的因素，其中扩增效率的一致性是最大的难题，检测重数越多，效率一致性往往越低。针对多重PCR扩增效率一致性的问题，传统单管多靶标扩增的方式通过不断优化反应体系中缓冲液、酶、引物、探针等的用量，确保每一重的扩增效率保持一致，然而随着检测重数的增加，形成二聚体甚至多聚体的可能性也大幅上升，轻则导至非特异性扩增的出现，靶标扩增效率下降，检测灵敏度和特异性降低，重则导至非特异性扩增占据主导，靶标扩增失败，造成假阳性和/或假阴性，影响检测准确性。
而基于微流控的多重PCR则将每一重的扩增分布在各自相对独立的空间内进行，在一定程度上降低了引物二聚体的生成，保证了扩增效率，但是微流控的实现相对较为困难，且当模板浓度较低时，易产生假阴性结果。相比基于微流控的多重PCR，基于固相载体表面扩增的多重PCR则将不同的引物对分配至不同的固相载体上，使得每个靶标的扩增集中于以特定固相颗粒为载体的表面，从根本上解决多重PCR引物间相互干扰的问题，此外将固相载体表面扩增与 Luminex 液相芯片检测技术相结合能够同时对各固相颗粒及颗粒表面的扩增信号进行特异性识别，并且理论上能够实现100 重的核酸扩增与检测，极大地提高了检测重数的同时又能保证各靶标的扩增互不干扰，但是由于需要将引物束缚至固相载体，这在一定程度上限制了引物与模板的碰撞概率并且导至其扩增效率降低，那么如何提高固相载体表面的扩增效率值得深入思考。

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