知识分享 | 学会几种PCR，走遍天下都不怕！

千姿百态

PCR实验过程

PCR的原理是以母链DNA为模板，特异性引物为延伸起点，通过变性-退火-延伸等步骤，可以使目的片段在短时间内以指数方式倍增。

根据实际实验的不同需求，如特异性增强、反应时间缩短、扩增复杂模板、扩增长片段等，在常规PCR基础上经过不断地改良和调整，延伸出不同的PCR类型，接下来我们为大家介绍四种不同类型的PCR。





01降落PCR(Touchdown PCR)
降落PCR是通过对反应体系中退火温度进行优化来提高反应的特异性。在降落PCR中，根据引物的Tm值，设置一系列从高到低的退火温度，在最开始循环中的退火温度高于引物的Tm值，之后每一个（或n个）循环降低1℃（或n℃）退火温度，直到退火温度降低到最佳温度（通常比引物的Tm值低 2~5℃），剩余的循环都维持此退火温度。

降落PCR的基本原理是一开始使用较高的退火温度可避免引物二聚体和非特异性产物的形成，保证扩增产物的特异性，之后的循环中逐渐降低退火温度，提高扩增的效率。在初始循环中，特异性产物的量达到一定丰度，后续低退火温度扩增循环中，虽然扩增的特异性降低，但非特异位点结合的竞争力要低于特异性位点，因此产生单一的占主导地位的特异性扩增产物。



降落PCR

注：通过以较高的温度起始，再随着循环逐渐降低到最佳退火温度（黑色曲线），这种PCR方法可提升反应特异性（黄色曲线）。目标扩增子的产量（绿色曲线）相应的得到富集。

降落PCR适用于不确定引物的最适Tm值，或引物扩增效果不佳时，不了解目的模板同源性程度，使用降落PCR可以快速、特异的得到目的扩增片段。根据不同实验的需要，降落PCR还可与其它PCR方法同时使用，如实时定量降落PCR、竞争降落PCR等。

02巢式PCR (Nested PCR)
巢式PCR 通常涉及两轮连续PCR反应，需要设计两对引物，第一轮PCR是用一对外引物扩增得到包含目的片段的较长产物，将其经过稀释以后作为第二轮PCR的模板，再用另一对内引物（巢式引物，位于第一轮PCR产物的内部）进行第二轮PCR，得到的产物为目的片段。


两对引物：外引物在目的片段的侧翼，内引物在目的DNA片段的准确区域。



巢式PCR原理图

巢式PCR的特点：

特异性强：使用两对引物进行扩增提高了特异性，第一轮PCR中由外引物错配产生非特异性产物，同时在第二轮PCR中内引物与错误片段配对扩增的概率极低，降低了扩增多个靶位点的可能性。

灵敏度高：进行两轮PCR扩增，可以执行更多的循环，从低拷贝样本中扩增得到足量的产物，克服了单次扩增平台期限制，提高PCR的灵敏度。

巢式PCR大多应用于模板DNA含量较低的情况，一次PCR难以得到满意的结果，用巢式PCR的两轮扩增可以得到足够的特异性产物。

03数字PCR（Digital PCR，dPCR）
数字PCR（Digital PCR，dPCR）是一种核酸分子绝对定量技术。数字PCR是最新的定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。



数字PCR

除了基因表达和拷贝数检测，数字PCR也适用于诸如低频等位基因的辨别、病毒滴定和二代测序文库的绝对定量。

04重叠延伸PCR (gene splicing by overlap extension PCR，SOE PCR)
重叠延伸PCR技术 (gene splicing by overlap extension PCR，SOE PCR)，是采用具有互补末端的引物，使 PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。

这项技术目前主要有以下应用方向：扩增长片段DNA，构建融合基因；基因定点突变。



用重叠延伸PCR技术构建融合基因



利用重叠延伸PCR技术进行基因定点诱变
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来源：Super Lab、IVD网

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