冰冻切片免疫荧光（Immunofluorescence Staining）实验基本原来与步骤

笑看风云

1 冰冻切片免疫荧光
免疫荧光染色(Immunofluorescence, IF)是一种重要的免疫化学技术，可以显示任何给定组织或细胞类型中几乎许多成分(蛋白)的技术。IF主要结合了生物学、免疫学和显微镜技术将感兴趣的靶标进行可视化。IF显色的基本原理是通过荧光团标记的特异性抗体与组织/细胞内抗原的组合来实现的。与免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)相比，IF 具有极高的灵敏度和放大信号的能力，因此被更广泛的用于组织/细胞内靶标的可视化[1]。



（图1 免疫荧光染色基本原理-直接法/间接法 [2]）

2 冰冻切片染色
2.1 IF实验前的注意事项
目前市面上根据提供的一抗是否携带荧光基团，分为直接IF和间接IF（在实验前务必认真阅读抗体说明书），此外，IF抗体不同于WB抗体，因为WB抗体对应的是加热变性的线性化蛋白，而IF是固定剂（如多聚甲醛等）是胞内蛋白（核酸或生物大分子）与固定剂发生共价结合从而稳定这些大分子在细胞内的结构，同时防止后期处理出现的变性或溶解，进而较好的展示蛋白在细胞亚定位。因此，要进行IF实验室，购买抗体务必购买能够进行IF实验级别的抗体 [3-5]。
2.2 冰冻间接IF实验实操
（1）冰冻切片复温：冰冻组织完成切片以后，一定要在30-37℃复温30min，防止脱片；
（2）冰冻切片固定：在进行组织OCT包埋时，未进行固定操作的组织，切片需要使用4%多聚甲醛（paraformaldehyde, PFA）室温固定30min-60min后使用PBS洗涤切片3次，每次5min；
（3）冰冻切片通透：IF通透一般使用0.3%Triton X-100（PBS配制）去垢剂室温作用15-20min，目的是使得抗体能够到达抗原所在位置（膜蛋白可不用通透），使用PBS洗涤切片3次，每次5min；
（4）冰冻切片封闭：一般使用与一抗，二抗不同种属的蛋白进行封闭，一般使用BSA (Bovine Serum Albumin)当然具体的也要根据具体实验的组织来源，建议使用商业化的封闭液（效果杠杠的），37℃作用2h或4℃过夜封闭（可以不用洗涤）；
（5）冰冻切片一抗孵育：使用PBST（0.3% Triton X-100）配制商品说明书工作浓度，对于多个一抗孵育时候，可以制备一支一抗混合液，需要注意的事，首先要确定物种不一样，此外每一种抗体的浓度要使用说明书的浓度。然后在说明书温度进行孵育或4℃孵育过夜（建议难搞的实验，因此时间长了更有利于抗原抗体的互作）。完成一抗孵育后可以进行一抗回收，然后使用PBS洗涤切片3次，每次5min；（备注：为了节省抗体，也可在使用阻断笔/石蜡笔画圈去圈住组织，然后使用少量抗体在湿盒中孵育）
（6）冰冻切片二抗孵育：对于间接IF，需要使用带有荧光基团的二抗进行避光孵育，一般是在37℃作用2h即可，完成二抗孵育后使用PBS洗涤切片3次，每次5min；
（7）冰冻切片染核：一般使用2μg/ml DAPI进行染核，然后有利于定位IF染色的靶蛋白亚定位，然后使用PBS洗涤切片3次，每次5min；
（8）冰冻切片封片：使用IF专用封片试剂（含有抗荧光淬灭剂），当然紧急情况下也可以使用40%左右的甘油进行封片；
（9）冰冻切片图像数据采集：对于要比较荧光强度的图像，一定要保证荧光显微镜的采集参数要保持一致；
（10）图像荧光数据统计：一般使用image J进行荧光强度统计，请参考GBhouse 2023年09月23日发表的推文《Image J测量细胞荧光强度protocol》。
3 冰冻切片IF实验注意事项
（1）在进行IF实验室务必准备好实验需要的耗材和试剂；
（2）需要再合适的温度（-15至-23℃）进行切片，可以防止冰冻切片破碎或褶皱；
（3）切片的厚度应控制好5-15μm，太厚了可能会因为冰晶导致组织破碎；
（4）如果出现脱片，在重分复温没效果的情况下，可以考虑使用含有明胶的载破片或特制的IF载玻片；
（5）多染时候，可以把多个抗体混在一起，但每个抗体的工作浓度需要根据说明书进行调整；
（6）IF染色完成后，尽快进行图像数据采集，一般超过24H，可能不能更好的显示处理组与对照组的差异。

爱自己！！！做科研!!! 每文格言经济学家薛兆丰："每一个人，每一个时刻，都是在为自己的简历打工。"如果有用，关注楼主GBhouse，点赞+讨论，攻击型人格请请请不要关注和阅读！！！

参考：
[1] Im K, Mareninov S, Diaz MFP, Yong WH. An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Methods Mol Biol. 2019;1897:299-311. doi: 10.1007/978-1-4939-8935-5_26. PMID: 30539454; PMCID: PMC6918834.
[2] https://pro.biomart.cn/lab-web/news/article/31m1ramgo210l.html
[3] https://zhuanlan.zhihu.com/p/117371825
[4] https://wenku.baidu.com/view/42a32279e309581b6bd97f19227916888586b929.html?_wkts_=1726654240325
[5] https://pro.biomart.cn/lab-web/news/article/31m1ramgo210l.html

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/720755020