数字PCR（Digital PCR）检测技术

病理医师

1. 数字PCR（Digital PCR）简介

数字PCR被称为第三代PCR，是一种高精度的核酸定量检测技术，相比于荧光定量PCR，数字PCR具有不依赖于标准曲线、操作更简单、灵敏度和精度更高（±10% copies/μL）、可实现多重甚至超多重核酸定量、更加适合低丰度目标的检测等优势。
2. 数字PCR的精度和检测方法

相比于其他的核酸定量技术（如分光光度计、荧光定量PCR和Qubit等），定量精度更高，其中分光光度计单位为ng/ul，荧光定量PCR单位CT（log浓度），而数字PCR单位是copies/ul，其定量精度一般要求在±10%。
数字PCR检测使用探针法较多，染料法较少；为了避免出现非特异性扩增，影响阈值的划分，从而导致定量出现偏差。数字PCR荧光探针和染料本质上是核酸扩增指示剂，数字PCR在配置反应体系时配方与荧光定量PCR相同，主要包括dPCR Buffer、酶、正向和反向引物、探针、模板及无核酶水；数字PCR的染料法中可使用EvaGreen和Picogreen染料，无法使用SYBR Green I染料。
3. 数字PCR的原理

将原本在一个PCR管反应体系中的模板和试剂分割到数万个独立的腔室中，每个腔室中的微反应体系进行独立的扩增，扩增完成后，检测每个腔室中扩增出的靶标分子即可完成定量检测。



数字PCR原理示意图

通过检测每个探针法或染料法检测每个腔室的信号是阳性还是阴性，判断腔室是否存在DNA分子，阳性为存在，阴性为不存在，但不能直接的通过阳性腔室的个数来计算DNA分子数，否则定量结果出现较大的偏差，需要通过泊松分布进行矫正。
DNA分子被随机分散到一个腔室内是一个概率问题，其概率服从泊松分布，但也可能存在几个DNA分子分割到一个腔室中；数字PCR最终计算的DNA浓度或DNA数量为每个腔室/液滴中的平均分子拷贝数，换算后计算公式如下：



计算公式

4. 油包水液滴式数字PCR（Droplet digital PCR， ddPCR）

如何将模板分割到独立的数万个微反应体系中，成为数字PCR的技术难题。早期采用人工或仪器平台加样，后来随着微流控技术的发展，油包水形式的液滴制备可快速制备大量的液滴，因此于2012年诞生了基于该技术的数字PCR，油包水的微流控芯片技术快速普及应用，在此基础上又诞生了试剂体系更加稳定的“固态油隔水”技术，纳米微孔板等技术。数字PCR（Digital PCR）检测技术.md

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