数字PCR的技术原理和关键技术是什么？

虎威将军

原创 幕后的小白 PCR技术学习
2024年10月26日 00:02 上海
该公众号的建立本意是学习一些关于多重PCR和数字PCR等前沿技术的知识，奈何很多小伙伴对于基础概念和知识的兴趣远远超过了前沿的知识，都是和幕后的小白差不多的水平，前期也就和小伙伴一起先学习一些基础知识了。
后续的一段时间，幕后的小白还是要学一些新的技术知识了，不然怕要跟不上时代发展了。
接下来的一段时间里，幕后的小白会先学习下数字PCR（Digital PCR）。
数字PCR普遍被称为“第三代”PCR，是一种可以实现“绝对定量”的核酸检测技术（其实，这里有点概念误区，幕后的小白在一篇文章中提到过：PCR、qPCR、dPCR、RT – PCR、RT-qPCR、Real-Time PCR；傻傻分不清？）。
数字PCR概念的提出并不比荧光定量PCR（qPCR）晚几年，但是受限于关键技术的难度（也就是试剂分割技术），发展速度远没有荧光定量PCR快。
数字PCR在1999年被明确提出，直到2007年才有第一台商用的数字PCR仪器（还是个半成品）（其实荧光PCR在1993年也才被提出，1996年就已经有了成熟的仪器），真正能用的产品2012年才正式推向市场。
图1 数字PCR概念的提出
很多人由于没怎么听说过，或者只是知道“第三代”PCR，对于其概念觉得比较复杂，也比较神秘，未来的一段时间，和幕后的小白一起，让本来就很简单的技术变得不再神秘！
以最简单的物理学的方式去理解，数字PCR的技术原理是非常简单的：就是把原本在一个PCR管中的试剂分割到上万份独立的微反应“管”内，每个微反应体系进行独立扩增反应，扩增结束后，检测每一个独立反应“管”内是否有扩增出的靶标分子即可！（嗯，把一管试剂分成几万管扩增就可以了！）
图2 数字PCR技术原理图
学习到这里，我们其实已经了解到了数字PCR的关键点，就是把模板独立分散到上万个微反应”管”内。听上去简单，做起来就难了！1999年数字PCR概念提出，直到2012年较为成熟的商用数字PCR产品才推向市场。
随之而来的是第一个问题，也是数字PCR最大的技术性问题，怎么把模板分散到上万个微反应管内？
在幕后的小白的另一篇文章中有一些论述：数字PCR如何引领潮流？内卷还是技术突破？
总结起来，大概有5个方面：
方案1：最早的技术就是采用384孔板和1024孔板，通过人工或者仪器平台去加样；（有几个研究人员能够忍受这样的折磨？所以1999年之后，好多年间没有得到大家的关注！）
方案2：随之微流控技术的发展，2007年，某公司采用气动阀控技术的微流控芯片成功应用于试剂的分割，在一张芯片上一次可以分割出1000多个微反应“腔室”，第一台商业化的数字PCR仪器诞生。奈何，一张芯片1000 RMB 以上，仪器也是巨贵无比，只有个别单位能够使用得起，分割数量少且价格极高，也就只能看看了。
方案3：微流控技术发展的过程中，有一个分支发展的非常快，就是液滴制备技术，主要是通过乳化方式实现“油包水”的形式。这种方案相比前面两种技术是一种飞跃式的进步，可以在2 min左右生成2万个液滴，2012年，一种基于“油包水”技术的数字PCR仪器诞生，数字PCR的科研普及化应用正式拉开序幕。
方案4：另外一个公司，依托固相硅基微孔阵列，基于表面亲疏水的差异化处理，实现在硅基腔室阵列芯片上实现液滴的制备，技术思路非常简单，液滴制备方便，但是其芯片结果稳定性很差（局部亲疏水处理在微尺度下存在一些相互的影响），也让早期的研究者对固相数字PCR微流控芯片有一些诟病之处。
因此，另外一个概念也被科研人员深深的植入了骨髓，ddPCR和数字PCR划上了等号。其实ddPCR是Droplet digital PCR的缩写，主要是油包水液滴式技术的数字PCR。数字PCR的缩写更准确的应该是dPCR（Digital PCR）。
方案5：油包水技术虽然得到了快速的普及化应用，但是试剂体系的封闭性和液滴稳定性一致受到不小的调整，很多后来者对于在微流控芯片的基础上进行更进一步的优化和调整，开发了更稳定的类似于“固态油隔水”技术，纳米微孔板技术等微流控芯片技术方案，实现了和油包水技术的平分秋色。
无论是什么技术，能够确保以更简单的方式把PCR试剂进行分割到上万个独立的微反应管内，就成功的实现了数字PCR最关键的一步！
您学废了吗？
随着学习的深入，我们的问题会越来越多：
1. 数字PCR如何实现核酸的“绝对定量”？
2. 数字PCR扩增信号如何检测？
3. 什么是“有限稀释”和“终点检测”？
4. 数字PCR到底有哪些优势？
5. 数字PCR可以应用在哪些领域？
.。。。
带着问题，让我们一点点的来了解数字PCR！
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