科研干货 | 详解qPCR实验流程步骤详解！

笑看风云

qPCR的原理

实时定量PCR（RT-qPCR）是一种在DNA扩增反应中，通过荧光化学物质测量每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法，常用于定量分析特定DNA序列。
也就是检测你的样品里，你关注的某些基因的表达了多少
(样品是你提取的RNA逆转录出来的cDNA,所以反映的是RNA水平)
怎么设计跑qPCR的板怎么加

1、要加的孔数=样品数×目的基因数×3重复
例：我有4个样品，6个目的基因(包括内参),那么要加的孔数是4×6×3=72个样品1样品2样品3样品4


2、大部分qPCR的体系(每个孔里的东西)如下：


（有些课题组为了节省成本,会把所有成分减半,总体积10ul）
3、每个孔都一个一个加，太麻烦!而且有些成分体积太小，误差会比较大，怎么办?
可以把样品和引物分开配好(例子是10ul体系):


qPCR小tips

1、好好戴口罩和手套，保护自己也保护样品
2、冰上操作，注意避光
3、操作过程中尽量不要和别人说话
4、在管或板中加液体时可以加在侧壁上，但是加完一定要离心
理想的溶解曲线应该显示单一的峰，表示只有一个特异性的PCR产物被扩增。如果溶解曲线出现多个峰，可能表示有多个PCR产物被扩增，即非特异性扩增或引物二聚体的存在，需要更换引物。
5、Ct值取决于多个因素，包括目标基因的表达水平、样本中模板的数量、引物和探针的效率等。理想的Ct值通常在15-30之间。Ct值大于35或者复孔间差距太大，需要谨慎选择是否使用这个数据。
附一张画好的96孔板方便大家使用


RT-qPCR的实验操作流程：

1、引物设计：引物设计需遵循一般原则，产物长度应控制在80-150bp，以保证扩增效率和特异性。
RNA提取：提取细胞总RNA，包括清洗、裂解、分离和沉淀RNA步骤。
2、RNA浓度测定：使用如Nano drop等仪器测定RNA浓度。
3、反转录合成cDNA：使用反转录酶将RNA转换为cDNA，作为qPCR的模板。
4、qPCR反应体系配置：实验通常使用2×浓缩的real-time qPCR MasterMix。需要加入模板和引物。每个样品至少做3个平行孔，以确保数据的可统计性。
5、上机操作：将配置好的反应液放入实时qPCR仪中，设置相应的温度循环和采集模式，进行扩增检测。real-time qPCR不需要常规PCR的三步法（变性、退火、延伸）。 由于产物长度短（80-150 bp），通常只需要变性和退火步骤。 使用SYBR Green等染料时，PCR后应加溶解程序以形成溶解曲线，判断特异性扩增。




6、数据分析：通过扩增曲线和融解曲线分析，可进行相对定量或绝对定量分析。相对定量用于比较靶基因在不同样本中的表达差异，绝对定量用于测定样本中靶基因的确切拷贝数。
7、常见问题分析：注意MasterMix不要反复冻融，常使用时可溶解后存放于4°C。 配制时应在冰上操作，每管或每孔换新枪头，避免加样误差。 如无Ct值出现、Ct值出现过晚、标准曲线线性关系不佳、负对照有信号、溶解曲线异常、扩增效率低等问题，需针对具体情况进行调整和优化。
实验准备和小技巧





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