RNA的提取与提纯

Rose

RNA和DNA对大家来说都非常熟悉，其本质都是核酸（一种由碳氢氧氮磷元素组成的化合物），只是在结构组成上有所不同，但是它们的基本组成单位都是核糖、磷酸和碱基。RNA中文叫核糖核酸，英文Ribonucleic Acid，与DNA相比，RNA的核糖比DNA多一个氧，因此DNA也称为脱氧核糖核酸，再者就是两者的碱基不同，RNA四种碱基主要是A/G/C/U，DNA是A/T/C/G。
DNA的主要功能是记录遗传信息，而RNA主要功能是转录和翻译DNA的遗传信息，其实RNA还有其他的一些功能，比如RNA是很多病毒的遗传信息，RNA也具有一定的催化作用。
本人最近在做RNA相关实验，因此需要用到RNA的提取和纯化，今天就和大家分享一下我用到的RNA提取和纯化的方法和心得，如果大家有更好的意见，也欢迎指正。



RNA提取过程

我本次用到的提取方法是Trizol法。
整个过程需要佩戴口罩和手套，用的EP管和移液管枪头都是RNAseFree的，也就是不含RNA酶的，因为RNA酶到处都有，可随时讲解提出的RNA。
一、细胞准备
我本次用的是PC-3细胞（一种前列腺癌细胞系），将细胞种于6孔板（分组情况根据情况设定）。待细胞长满后，用适量PSB洗两次，然后将残留的PBS吸干净。如果怕吸不干净，可将6孔板倒扣在吸水纸上，空干。
二、加入Trizol
将Trizol分别加入到6孔板中，每孔1mL，吹打充分裂解细胞后，将浆液转移至1.5mL的EP管中（用不含RNA酶的EP管），静置5分钟后，4℃ 12000g离心5分钟，将上清转移至新的EP管中。
注：TRIZOL的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，TRIzol中的8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇可以抑制内源和外源RNA酶。
三、加入氯仿
加入1/5体积Trizol的氯仿（CHCl3)，我用了1mLTizol，因此这里加入了200μL的氯仿。加入氯仿后，上下翻转混均匀，室温下静置5分钟，12000g4℃离心15分钟，然后将上清液转移至新的EP管中（抽取过程要轻柔，避免将中间的白色沉淀抽入）。
注：氯仿是良好的有机溶剂，可以将有机相和无机相分离，被trizol裂解的细胞各种结合了酚的蛋白质会被溶解在下层的有机相中，而RNA则在上层的无机相中。
三、加入异丙醇
加入0.5~1倍Trizol体积的异丙醇，本次我加入了500μL的异丙醇，震荡后室温静置5分钟，然后12000g4℃离心15分钟，保留沉淀，弃上清。
这一部分目的是将RNA沉淀。
四、加入75%的乙醇
向沉淀中加入与Trizol等体积的75%的乙醇，本次加入1ml乙醇，然后7500g4℃离心5分钟，弃上清，保留沉淀，降EP管倒扣在吸水纸上，尽量干燥。
注：这里用的乙醇是用DEPC水与无水乙醇配置的。此步骤的目的是将沉淀的RNA洗干净。
五、加入DEPC水中溶解
将最后的沉淀溶解于DEPC水中，一般加入30~100μL的DEPC水，可用枪头吹打，促进RNA的溶解，完成整个RNA的提取。最后可将样品保存在-20℃或-80℃。

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