荧光原位杂交(石蜡切片)

千姿百态

荧光原位杂交（FISH）是一种使用仅与染色体的那些部分高度序列互补性结合的荧光探针的分子细胞遗传学技术。它是由生物医学研究人员在20世纪80年代初开发的，用于检测和定位染色体上特定DNA序列的存在与否。荧光显微镜可用于找出荧光探针与染色体结合的位置。FISH通常用于发现DNA中的特定特征，用于遗传咨询，药物和物种鉴定。FISH也可用于检测和定位细胞，循环肿瘤细胞和组织样品中特定的RNA靶标（mRNA，lncRNA和miRNA）。
一、试剂配制
1.变性液：甲酰胺70%；2×SSC；0.1mM EDTA。
2.杂交缓冲液：300ul 甲酰胺；12ul 50×Denhardts；120ul 50%葡聚糖硫酸酯；；10ul RNA探针及49ul的无RNA酶的去离子水。
3. 20×SSC：175.3g/L氯化钠；88.2g/L的柠檬酸钠；调pH值7.0；高压蒸汽灭菌备用，使用时按照需求进行稀释。
4.WS-Ⅰ：甲酰胺50%(V/V)；20×SSC 10%(V/V)；DEPC水40%(V/V)。
5. WS-Ⅱ：4×SSC；0.05% Tween-20
6. WS-Ⅲ：4×SSC
以上所有试剂均用0.1%的DEPC水（焦炭酸二乙酯）配制。
二、 实验步骤
1. 脱蜡
1）在通风橱内用二甲苯脱蜡3次，每次5min；
2）无水乙醇漂洗两次，每次2min；
3） 移出酒精，斜置切片，标记末端向下，空气干燥。
2. 蛋白酶K处理
1）在染色缸内加入适量的蛋白酶K反应液，将切片一次放入切片架上，浸入蛋白酶K反应液中。
2）将染色缸放入37℃水浴锅中孵育20min。
3）用2×SSC在室温下漂洗切片3次，每次2min。
4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）50%、70%、90%、100%。
3. 变性
1）向染色缸内加入适量的变性液
2）75℃水浴锅中平衡预热混合液染色缸
3）将片子放入盛有变性液的染色缸内75℃孵育8min
4）同时将含有DNA两种探针的杂交液分别于75℃孵育8min（注意：含有杂交液的EP管外面用锡箔纸包裹，以防探针荧光消失）
5）将片子移入-20℃预冷的70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的20℃预冷的酒精内，每次2min。
6）空气中干燥。
4.杂交
1）在每个玻片的标本区分别加50ul已变性的探针，放入湿盒中。
2）42℃烘箱杂交过夜（12-16h）。
5.杂交后的洗脱
玻片依次于洗脱液Ⅰ（WS-Ⅰ）中45℃洗3次；每次2min，洗脱液Ⅱ中
（WS-Ⅱ）25℃洗3次，每次2min；洗脱液Ⅲ（WS-Ⅲ）中25℃洗3次，每次2min；酒精梯度脱水风干玻片。
文章来自：无锡菩禾生物医药技术有限公司


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