蛋白质分离纯化方面，AKTA快速蛋白分离系统和HPLC 的差别？

虎威将军

1、在蛋白质分离纯化时，AKTA和制备型HPLC的区别是什么？（原理上、应用上和分离效果上）
2、AKTA分离纯化蛋白和制备型HPLC的排阻法分离蛋白的优劣？
3、AKTA分离纯化蛋白时必须用镍离子柱亲和层析的方法吗？还有其他分离纯化的方法（或不同柱子）吗？
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卡卡

一、根据分子大小不同的纯化方法
1. 透析和超过滤
（1）透析是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开的一种技术。常用的半透膜是玻璃纸（又称赛璐玢纸）、火绵纸（又称璐琔纸）和其他改型的纤维素材料。透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降低到最小值为止。
（2）超过滤，又称超滤，是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。
2. 密度梯度（区带）离心
（1）蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。
（2）如果蛋白质在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区带，将分成区带的蛋白质分部收集，每个组分进行小样分析以确定区带位置。
3. 凝胶过滤
凝胶过滤又称凝胶过滤层析、分子排阻层析或凝胶渗透层析，是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一，原理参考凝胶过滤测相对分子质量。
凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝 胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。
二、利用溶解度差别的纯化方法
1. 等电点沉淀和pH控制
（1）等电点沉淀技术：在等电点pH条件下，蛋白质为 电中性，其物理性质如导电性、溶解度、黏度、 渗透压等都表现为最低值，易发生絮结沉淀。因 此，等电点性质常被用于蛋白质的分离制备，被 称为等电点沉淀技术。
（2）当pH被调至目的蛋白质的等电点时，目的蛋白质大部分或全部沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。
2.  蛋白质的盐溶和盐析
（1）盐溶
① 盐溶是指中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著的影响，可以增加蛋白质的溶解度的现象；
② 盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高；
③ 球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。
（2）盐析
① 盐析是指当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质溶解度开始下降。当离子强度增加到足够高时，很多蛋白质能够从水溶液中沉淀岀来的现象；
② 盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水，暴露了疏水基团。随着盐浓度的增加，蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀；
③ 同样浓度的二价离子的盐溶或盐析作用强于单价离子。
3. 有机溶剂分级分离法
（1）与水互溶的有机溶剂能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。
（2）有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数；另一重要方式是有机溶剂与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚集而沉淀。
4. 温度对蛋白质溶解度的影响

在一定温度范围内大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，在40～50℃以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性pH介质中失去溶解力。
三、根据电荷不同的纯化方法
1. 电泳
（1）电泳概念
电泳，又称离子泳，是指在外电场的作用下，带电颗粒，如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动的现象，可用于氨基酸、肽、蛋白质和核苷酸等生物分子的分析分离和制备；
（2）电泳分类
① 自由界面电泳
② 区带电泳
第一，滤纸电泳和薄膜电泳（如碏酸纤维薄膜电泳和聚酰胺薄膜电泳）；
第二，粉末电泳，支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和，铺设成平板；
第三，细丝电泳，如尼龙丝和其他人造丝电泳，这是一类微量电泳；
第四，凝胶电泳，最常用的支持介质有聚丙烯酰胺凝胶（适于分离蛋白质和寡核苷酸）和琼脂糖凝胶（适于分离核酸）。
2.  聚丙烯酰胺凝胶电泳
（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），又称圆盘凝胶电泳或圆盘电泳，是指以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板，凝胶是由相连的二部分组成，电泳时样品首先在不连续的两相间积聚浓缩而成很薄的起始区带，然后再进行电泳分离的过程。
（2）在侧盘电泳过程中有3种物理效应。
① 样品的浓度效应；
② 凝胶对被分离分子的筛选效应；
③ 一般电泳分离的电荷效应。
3.  毛细管电泳
（1）毛细管电泳技术泛指高效毛细管电泳、毛细管区带电泳、自由溶液毛细管电泳和毛细管电泳，电泳是在微内径管中进行的。
（2）使用毛细管的一个优点是它减少了由于热效应产生的许多问题。因为管的孔径小，面积与体积之比大，这样可以提高热散失，有助于消除由于热引起的扩散增加而造成的对流和区带变宽，因此管中不需要加入稳定介质就可进行自由流动电泳。


4.  等电聚焦
（1）等电聚焦，又称电聚焦，是一种自由界面电泳。利用这种技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH梯度处，并形成一个很窄的区带；
（2）pH梯度制作一般利用两性电解质，它是脂肪族多胺和多羧类的同系物，它们具有相近但不相同的pKa和pH值。在外电场作用下，自然形成pH梯度。
5.  层析聚焦
（1）层析聚焦又称聚焦层析，是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法；
（2）用特种多缓沖液淋洗层析柱中的特种多缓冲交换剂，就会在柱中产生一个由上而下的pH梯度，随着pH梯度向下移动，达到等电点的蛋白质将按照先后顺序被洗脱下来。
6.  离子交换层析
（1）离子交换层析
离子交換层析是指以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差別而进行分离的一种层析方法，蛋白质对离子交換剂的结合力取决于彼此间相反电荷基团的静电吸引，而这又和溶液的pH有关。
（2）离子交换剂
离子交换剂是在惰性基团上结合有离子交换基团。
① 纤维素离子交换剂，其具有松散的亲水性网状结构，有较大的表面积，大分子可以自由通过。所以洗脱条件温和，蛋白回收率较高。
② 交联葡聚糖交换剂，既可根据分子的浄电荷数多少又根据分子的大小进行分离。
四、利用选择性吸附的纯化方法
1.  羟磷灰石层析
吸附剂羟磷灰石又称结晶磷酸钙，用于分离蛋白质或核酸。羟磷灰石的吸附机制可能与其表面上的钙离子和磷酸根有关，涉及偶极－偶极相互作用，可能还有静电吸引。
2.  疏水作用层析
（1）疏水作用层析是根据蛋白质表面的疏水性差别发展起来的一种纯化技术。
（2）在疏水作用层析中，不是暴露的疏水基团促进蛋白质与蛋白质之间的相互作用，而是连接在支持介质上的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水基团结合。
五、利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法
亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离 物质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到 某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装 柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此 生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在 柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方 法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来， 从而达到分离提纯的目的
1. 凝胶素亲和层析（凝集素和糖蛋白）
2.  免疫亲和层析（抗原和抗体）
3.  金属鳌合层析
4.  激素和受体蛋白


六、高效液相层析和快速蛋白质液相层析
1. 高效液相层析（HPLC）是离子交换、分子排阻、吸附和分配等层析技术的发展新阶段，采用自动似器操作，具有更高的效率，分辨率和更快的过柱速度；
2.  分离纯化原理与柱层析相同，载体的颗粒意小、则分辨率意高，但是洗脱液的流速也愈慢；
3.  反相HPLC广泛用于分离非极性化合物如药物及其代谢物、杀虫剂、氨基酸和肽等；
4.  快速蛋白质液相层析是专门用于蛋白质分离的。它没有自己特有的原理，只是基于反相、亲和、排阻、疏水作用、离子交换和等电聚焦等层析。


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【亲和层析】固定化亲和层析分离目的蛋白