RP-HPLC | 多肽，蛋白的纯化与分析（15.结）-蛋白鉴定

幸福侠侣

色谱分析
色谱技术已发展成一种强大的分离技术，能够分离大量多肽和蛋白质。
但任意一种单独的色谱技术仍然只能分离出一小段蛋白质。
因此，多种色谱技术的结合使用已成为蛋白质组分析中蛋白质分离的一种普遍方法。
二维色谱
在长期的蛋白质纯化模式的基础上，John Yates和同事开发了一种名为MudPIT的蛋白质组分析技术。
在该技术中，采用胰蛋白酶等蛋白水解酶将蛋白质组中的蛋白质水解成分子量相对较小的多肽。
随后利用离子交换色谱法通过逐步增加盐浓度将这些肽分离。
每一步，略提gao盐浓度，将结合能力较弱的肽洗脱至反相磁珠。流动相为乙腈梯度洗脱液，借助疏水性洗脱多肽。
MudPIT 法中，依次将离子交换磁珠和反相磁珠装入毛细管柱，从反相部分流出的洗脱液直接进入电喷雾质谱仪（图1）。



图1.MudPIT包括通过离子交换色谱法

MudPIT包括通过离子交换色谱法实现的整个蛋白质组蛋白酶水解产物的初步分离以及对离子交换分离出片段中多肽的反相分离。将离子交换磁珠和反相磁珠装入毛细管柱，从反相部分流出的洗脱液直接进入电喷雾质谱仪。
这一过程重复多次，能够实现蛋白质组水解产物肽的分离（图2）。
二维色谱法分离蛋白酶水解产物多肽的优点是将蛋白质分解成肽,允许凝胶电泳法无法实现的蛋白质分离和鉴定，例如一些疏水性膜结合蛋白和低丰度蛋白。
缺点是有关PTM的信息通常在MudPIT法中丢失。
此外，形成肽的数量要远远多于蛋白质，平均每个蛋白质水解得到20~50个肽，且需要分离。



图2.MudPIT中，盐浓度的逐步增加会使多肽洗脱至柱的反相部分，且乙腈梯度洗脱液会根据疏水性分离多肽。

PTM信息通常在 MudPIT 法中丢失。此外，形成肽的数量要远远多于蛋白质，平均每个蛋白质水解得到20~50个肽，且需要分离。
昂拓莱司常规做法是使用亲和色谱法，固定金属亲和层析和卵磷脂亲和层析，以在离子交换分离前或后期进一步分离多肽的亚片段。
蛋白质鉴定
用凝胶电泳法分离的蛋白质通常用蛋白酶水解（多数情况下为胰蛋白酶），通过 MALDI 质谱分析得到的多肽，并借助蛋白数据库鉴定。
通过MudPIT和相关方法分离的肽进入电喷雾质谱仪，并借助蛋白质数据库通过质谱法和串级质谱法鉴定。
当鉴定出某种蛋白质的几种肽时，可相应鉴定出该种蛋白质。
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