干货分享：一文带你读懂原位杂交

HaHa

什么是原位杂交
原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程，原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。
原位杂交实验原理：
原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定，具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)，有与探针结合的标记物。
原位杂交应用
（1）细胞特异性mRNA转录的定位，可用于基因图谱，基因表达和基因组进化的研究。
（2）感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位。
（3）癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测。
（4）基因在染色体上的定位。
（5）检测染色体的变化，如染色体数量异常和染易位等。
（6）分裂间期细胞遗传学的研究，如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定，某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等。
原位杂交实验流程
探针设计-探针合成-样品处理-杂交预实验-杂交正式实验-荧光拍照
原位杂交注意事项
1.组织取材
组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min内固定。
2.细胞组织固定
目的：
（1）保持细胞结构;
（2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平;
（3）使探针易于进入细胞或组织。
注意事项：
最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿诱进入细胞或组织。
3.原位杂交杂交液
（1）杂交液内除含一定浓度的标记探针外，还含有较高浓度的盐类、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等。
（2）杂交液中含有较高浓度的Na+可使杂交率增加，可以减低探针与组织标本之间的静电结合。
（3）甲酰胺可使杂交温度降低，所以杂交液中加入适量的甲酰胺，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落。
（4）硫酸葡聚糖能与水结合，从而减少杂交液的有效容积，提高探针有效浓度，以达到提高杂交率的目的。
4.原位杂交探针浓度
①探针浓度依其种类和实验要求略有不同，一般为0.5—5.0 ug/ml(0.5—5.0 ng/ ul)。
②最适宜的探针浓度要通过实验才能确定。
③探针的长度一般应在50-300个碱基之间，最长不宜超过400个碱基。
④探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。

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