原位杂交实验指南

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一、什么是原位杂交？
原位杂交组织（或细胞）化学，简称原位杂交（In Situ Hybridization，ISH），它是运用已知碱基序列并带有标记物的核酸探针与组织细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再运用与标记物相应的显示或检测系统，通过组织化学或免疫细胞化学等方法在核酸原有的位置进行细胞内核酸（DNA、RNA）定位的一种检测技术。
目前，原位杂交技术在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面展示了分子生物学的一重要方向。
二、原位杂交的分类
根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类，其稳定性依次增大。
根据探针的标记物是否具有放射性，原位杂交又可分为同位素标记探针法和非同位素标记探针法两类。同位素标记探针法是用放射性同位素标记探针与靶核酸进行杂交，杂交后可用敏感性高的放射自显影技术检测。常用的放射性同位素如3H、32P、35S、125I等。非同位素标记探针法一般用半抗原标记探针，如生物素（Biotin）、地高辛素（DIG）等，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交最初是以同位素标记探针进行的，这种方法敏感性高，但核素具有半衰期限制、放射性污染且该方法成本高、耗时长，对实验人员具有辐射危害。而非同位素标记探针虽然在敏感性方面不如同位素标记探针，但其稳定性和分辨力高，检测时间短，一般在24h即可得到结果，同时操作简便，没有放射性污染的安全问题。因此，非同位素标记探针(尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针)迅速发展，逐渐成为原位杂交技术的主流方法，更受科技工作者的关注与青睐。
三、原位杂交选择指南
1、生物素标记探针or地高辛标记探针?
地高辛标记技术源于一种从洋地黄类植物中提取的类固醇物质——Digoxigenin（DIG）。由于Digoxigenin在自然界中来源单一，因此抗DIG的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性标记的需要。同样是小分子标记物，生物素广泛存在于各种组织中，对于灵敏度很高的标记检测实验来说，样品自身含有的内源生物素，就会对结果产生干扰。地高辛就能够很好地避免这个问题。
2、PCR法or随机引物法?
如果有足够量的高纯度模板，可以采用随机引物标记方法。而当只能获得有限量模板，或模板仅仅部分纯化，或模板非常短时，PCR标记是制备DIG标记探针的优选方法。它比其他方法需要更少的优化，且标记探针产量高。在PCR标记过程中，热稳定聚合酶会在扩增模板DNA特定区域时结合DIG-dUTP。其生成的是高度标记、非常特异、且非常敏感的杂交探针。
市场上主要使用随机引物法的试剂盒如罗氏的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I 和II，标记效率较高；主要使用PCR法的试剂盒如常州百代生物的BIOG地高辛标记试剂盒，盒内特别的采用了超级热启动Taq酶，大幅提升了探针的杂交活性，与随机引物法相比，具有非常显著的性能优势，可以通过杂交检测到极低拷贝甚至是单拷贝基因。
3、地高辛标记的探针免疫酶学检测方法Dig –HRP or Dig –AKP？
常用的免疫酶学检测方法有两类：
·Dig –HRP（辣根过氧化物酶）检测体系：以DAB（四氢氯化二氨基联苯胺）/H2O2为底物，结果为棕色；或以4-氯-1-萘酚/H2O2为底物，结果为蓝色。
·Dig –AKP（碱性磷酸酶）检测体系：以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀。
与免疫细胞化学方法相似，如应用酶促反应会较单一信号的标记物如荧光素具有更高的灵敏度。同样是酶促化学反应，AKP灵敏度和分辨率较HRP高约10倍左右。以BIOG地高辛标记探针原位杂交检测小鼠肝脏组织汉坦病毒感染为例（图1），以碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，与组织细胞中通过原位杂交定位结合的地高辛标记探针高效结合，再通过NBT/BCIP显色，即可灵敏准确地展示出所要检测的靶基因及其细胞定位，可广泛用于组织原位杂交、细胞原位杂交和染色体原位杂交等。



图1  BIOG地高辛标记探针原位杂交检测小鼠肝脏组织汉坦病毒感染

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