分子克隆Part1：载体构建系列之“酶切酶连”

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背景
20 世纪 60 年代，在细菌细胞中发现通过限制酶抵制噬菌体的攻击，提出限制性内切酶的假说。随后，科学家在细胞中发现了一种能在 DNA 上核苷酸的特定连接处以特定的方式把 DNA 双链切开的限制性内切酶。此外，他们又发现了另一种DNA 连接酶，这种酶能把二股 DNA 重新连接起来。随着位点特异性限制性内切酶家族的不断发现，一种沿用至今的经典 DNA 重组技术诞生了—— “酶切酶连”。
原理
“酶切连接”克隆法，即Golden Gate克隆法。在目的片段的两端通过引物引入跟质粒载体末端相同的限制性酶切酶位点，一般是 4~8 个碱基的识别位点， 将 PCR 产物酶切后回收。最后用 T4 连接酶将线性质粒载体和目的片段连接。该方法可以实现定向克隆，也可以变换不同的质粒载体。具体是将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，通过抗生素筛选出重组子，之后通过酶切电泳的方法进行鉴定。重组DNA转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。因此必须使用各种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子，并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组子。


既然需要构建载体，首先介绍下常用载体的类型：


常用载体分为克隆载体和表达载体​：​
克隆载体构建无论是平末端载体还是T-载体都是通过T4 DNA连接酶催化5磷酸和3羟基形成共价键，T-载体利用碱基A和T的互补将两个片段连接一起，平末端的连接是依赖于DNA分子间的碰撞，所以效率较低。
表达载体的构建一般通过双酶切的方法，相应的内切酶分别对载体和片段酶切，产物通过T4 DNA连接酶连接，此方法是目前使用最广泛的方法。可以将目的片段定向插入带载体中。以下主要介绍表达载体的构建。
完整DNA克隆过程包括五大步骤：
①目的DNA的分离获取(分)；②载体的选择与准备(选)；③酶切后目的DNA与载体的连接(连)；④重组DNA转人受体细胞(转)；⑤重组体的筛选及鉴定(筛)。概括起来就是五个字“分选连转筛”。
①目的DNA的分离获取：过表达编码基因通常选择基因的CDS区作为模板，通过化学合成、PCR克隆RACE等方法获取目的片段。
②载体的选择：根据克隆的目的选择载体，一是获取目的DNA片段，通常选用克隆载体。二是获取目的DNA片段所编码的蛋白质，需选择表达载体。另外，选择载体时还要考虑目的DNA的大小、受体细胞的种类和来源，还需要注意载体内应有适宜的单酶切位点或MCS，以便根据目的DNA片段，对载体进行适当的酶切处理。
③酶切后目的DNA与载体的连接：
酶切反应：工具酶
作为分子的剪刀手，限制性核酸内切酶可以识别特定的脱氧核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割。简称限制酶。
限制酶根据其反应的必须因子和切断点等特性，被分为以下三大类，应用于基因工程研究的限制酶一般都是II型酶。


限制性内切酶切割的DNA有两种形式，一种形式是交错切割方式，即在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，形成两种切口，5' 端和3'端突出的6个核苷酸的序列产生黏性末端；另一种切在同一位置上切割DNA的双链，从中心轴线切开，产生平末端。黏性末端利用末端碱基互补，效率远远高于平末端，通过两种不同产生不同末端的限制酶进行双酶切，可实现定向克隆；平末端连接困难，连接效率低，只有黏性末端连接效率的1%，黏性末端与平末端连接。




连接反应：工具酶
作为分子的胶水，DNA连接酶可以连接DNA链3'-OH末端和5'-P末端，生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。
常用的DNA连接酶有两种：
1) E.coli DNA连接酶
来源于大肠杆菌，主要功能就是在DNA聚合酶I催化聚合时，填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口，多用于连接黏性末端；
2) T4 DNA连接酶
来源于T4噬菌体，是ATP依赖的DNA连接酶，催化两条DNA双链上相邻的5'磷酸基和3'羟基之间形成磷酸二酯键。可接双链DNA的平末端、相容黏末端及其中的单链切口，可用于连接黏性末端和平末端，黏性末端连接效率大于平末端。
黏性末端的连接
同一内切酶或不同内切酶切后，可以产生相同的黏性末端，同时这些黏性末端是互补的。容易发生自连，为了避免同源分子的自身环化反应：（1）需用两种不同的限制酶同时切割外源DNA和载体，生成不同的黏性末端，使两种分子只能重组而不能环化，实现定向克隆。（2）适当控制载体和外源DNA分子的浓度。实验证明，当DNA的浓度低于20 μg/ml时，DNA分子趋于自身环化，而高于300 μg/ml时，则趋于重组。这可能是由于底物浓度提高，随机碰撞的概率提高之故。
平末端的连接
利用DNA连接酶对平末端DNA片段也能进行连接，但所需底物浓度高，连接效率低。一般需要将平末端进行修饰或改造形成黏性末端后再进行连接。通常可通过下列两种方法。
添加人工接头：人工接头为一段寡聚脱氧核糖核酸链，链内含有一种内切酶单切点。将人工接头连到DNA分子的两端后，即用该酶消化切割，生成黏性末端，然后再进行重组连接。
加同聚核苷酸尾巴：应用末端转移酶，在底物的3'-OH上加同聚核苷酸尾巴，即在载体和外源性DNA分子的3'-OH上，加上互补的足够长的同聚核苷酸，经过退火可以形成氢键结合。例如，在外源基因上加poly(dA)，而在载体上相应加上poly(dT)或者连接T载体。这样通过退火(复性)使互补的单核苷酸以氢键结合，使两个DNA片段连接起来，形成重组载体。重组质粒电转或化转大肠杆菌，进行筛选和鉴定。
④重组DNA转人受体细胞：
DNA导入宿主细胞的常用方法：
转化( trasomaion)：是指将外源DNA直接导人细菌、真菌的过程，例如，重组质粒导入大肠杆菌。然而，只有细胞膜通透性增加的细菌才容易接受外源DNA，这样的细菌称作感受态细胞( competent cells)。实现转化的方法包括化学诱导法(如氯化钙法)、电穿孔法等。
转染( transfection)：是指将外源DNA直接导入真核细胞(酵母除外)的过程。常用的转染方法包括化学方法(如磷酸钙共沉淀法、脂质体法等)和物理方法(如显微注射法、电穿孔法等)。
感染(infection) ：是指以病毒颗粒作为外源DNA运载体导人宿主细胞的过程。 例如，以噬菌体、逆转录病毒、腺病毒等DNA作为载体构建的重组DNA分子，经包装形成病毒颗粒后进人宿主细胞。
⑤重组体的筛选及鉴定：
利用载体上的抗性标记筛选
将含有某种抗生素抗性基因的重组载体转化宿主细胞，在含相应抗生素的培养液中培养此细胞，若细胞能在这种条件下生长，则说明细胞中导入了载体，适合初筛，还需要进一步鉴定。若细胞中没有载体，则被抗生素杀死。如抗氨苄西林基因(Amp')，如果目的基因插入到载体的位点在抗生素基因之外，将转化后的重组体细胞置于含有相应抗生素的培养基上，仍可长出菌落。
蓝白斑筛选法
蓝白斑筛选法又称β-半乳糖苷酶显色反应法或a-互补筛选。例如pUC质粒系统、pEGM质粒等系统。它们的共同特点是载体上携带一段细菌的LacZ(β -半乳糖苷酶)基因，如果在载体的LacZ基因中插入外源DNA，造成LacZ基因失活，失去分解X-gal的能力。在X-gal平板上，含阳性重组体的细菌为白色菌落，非重组体转化的细菌为蓝色菌落。


PCR法：利用序列特异性引物，经PCR扩增，可鉴定出含有目的DNA的阳性克隆。如果利用克隆位点两侧载体序列设计引物进行PCR扩增，再结合序列分析，便能可靠地证实插入片段的方向、序列和可读框的正确性。
DNA测序法，该法是最准确的鉴定目的DNA的方法。针对已知序列，通过DNA测序可明确具体序列和可读框的正确性，针对未知DNA片段，可揭示其序列，为进一步研究提供依据。
一般的做法是抗生素筛选后，进行PCR扩增，挑选阳性克隆进行DNA测序。
传统酶切酶连技术存在的问题
受限制性酶切限制，需要考虑酶切位点的兼容性
插入DNA需引入酶切位点及保护喊基，操作步骤繁琐，实验历时长。
保证酶切时的效率/避免星活性
单片段连接，无法同时进行多片段连接
适合于低通量的载体构建，无法进行高通量的载体构建。。。
鉴于酶切酶连的诸多问题，一个简单快捷的载体构建技术诞生了---无缝克隆，小伙伴们期待下一期内容 载体构建系列之“无缝克隆 ” 了解详情吧。

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