《Nature》子刊， 液滴微流控相关！

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想象一下，如果我们身体里的细胞无法全部打乱成均匀分布会怎样？实际上，在那种情况下，基本已经只能算是一个巨型的多细胞团了，因为在生物体内，只有各种不同的细胞能够被精确的分选定位，才能形成一个具有多功能分区能够执行正常生理活动的生物有机体。类似的问题如果放到人工研究体系，也是殊途同归，比如近年来发展的液滴微流孔是一种强大的技术平台，可用于多种生物学应用，包括单细胞遗传学、抗体发现和定向进化，但要想筛选在化学组成上不同的液滴目前仍面临困难。可事实上，在化学成分不同的液滴中进行以细胞为基础的生物化学分析具有许多独特的优势，尤其是在减少样品量、成本以及提高产量等方面。此外，根据所需特征对不同组分液滴进行分类的能力十分关键，特别是在分离生物或化学筛选的命中，如可溶性细胞产物如抗体的筛选以及药物的筛选等。因此，按需分选生产具有不同化学组成的液滴对基础和临床研究都具有重大意义。



图1 液滴微流控技术。

【新方法&新平台】
近日，来自欧洲分子生物学实验室的Christoph A. Merten教授团队设计了一种升级版的微流控技术平台（microfluidic Braille valve platform，简称Braille Display，BD），用于按需生成具有不同化学成分（16种不同试剂及其组合）的液滴，并且能根据荧光信号对具有不同化学性质的液滴进行分选。该技术平台结构紧凑，功能多样，并且成本效益较高。在应用测试方面，这一新型微流控技术平台成功完成了针对74种情况筛选癌细胞药物敏感性的全过程，且能够根据酶活性对不同的液滴的分类。相关研究内容以“A  microfluidic  Braille  valve  platform  for on-demand  production,  combinatorial  screening and  sorting  of  chemically  distinct  droplets”为题发表于《Nature Protocols》。





图2 微流控技术集成平台用于药物筛选和液滴分选。

【平台搭建】
首先就是设计芯片构造，在微流控芯片的常规基础上，BD平台采用64个针口以4×16的矩阵进行排列，并安装控制器用于驱动，打开和关闭上述芯片上的微流体阀。从而可以控制和混合16种注入溶液或在微流体流道中分选液滴（每个分选通道仅使用4个针口）。整体建造流程，可以列为以下几点：微流体芯片模具制备  用于筛选或分选芯片制造的晶片制备  光致抗蚀剂的制备  掩模对准器设置和曝光  后烘烤  显影  环氧树脂模具  用于药物筛选或分选模块的PDMS芯片制备  芯片生产  定制BD控制器。其他有关制造BD控制器和模具测试的具体细节建议读者可以于官网的补充材料中获取。



图3 总体芯片以及组合控制生产示意图。

【系统配备】
将芯片平台建造好后，则需要定制设定灵活的软件控制系统，来实现多样的功能，充分发挥BD的强大性能。为了充分适配和发挥平台的多样功能，研究者共设计了12种应用程序用于实现不同的实验目的，例如应用程序A：药物筛选型，其中还包括数据分析的详细信息；以及应用程序B：液滴分选型，包括分选芯片的制备、实验设置和数据评估。该研究提出方法中所有的相关应用程序包均附于官网，可供下载进行适配使用。



图4 分析方法的工作流程示意图。

【应用示例】
组合药物筛选
在进行组合药物筛选时，主要分为三个步骤：（i）药物和对照品的制备；（ii）编码（barcoding）;（iii）BD上的芯片对接。对于该研究设计的平台，体系优化后选择在每个样本约100个细胞的群体水平上进行分析，从而可以保障更多的细胞-细胞相互作用，提高药物反应。然而，从细胞群体水平来看，只有最有效的药物或药物组合才能被识别，而单个耐药克隆可能无法分析到。因此，BD平台也被用于生成具有不同化学成分的单细胞液滴（每个受试药物约250个重复组），从而实现对单个耐药克隆的识别。然而，想要尝试的读者们需要注意，单细胞液滴形式阻止了几乎所有类型的细胞-细胞相互作用，因而可能导致药物敏感性的改变，大家可以根据自己的具体应用和科学问题选择分析模式，或者是进行两种模式的混合筛选。



图5 组合药物筛选的实验装置及过程。

液滴筛选
BD技术的另一个应用是其用于化学上不同的液滴进行分类筛选。该研究首先采用了基于荧光的条形编码策略，只要样品保持在连续微流阵列中，这些荧光编码策略就可用于明确标记所有的液滴。此外，研究进一步通过在封装前用抗体对细胞进行染色来确定每个栓塞的相对细胞数，以提高微流体筛网的可靠性。所使用的抗体可以与生物酶偶联，该酶可以将安培红（Amplex Red）转化为试卤灵（resorufin），产生红色荧光达到对液滴的标记。
研究通过试验成功实现了基于图像分析的液滴、细胞和果蝇胚胎分选。此外，该平台可以进一步实现多达八种方式的分选模式，与常规的二元荧光强度不同，八向排序可以实现更细微的差异研究，如通过将液滴收集到不同强度的“箱”中并进行下游分析，可以研究目标群体中的荧光强度梯度，因此，BD分选集成的平台不仅可以分析不同药物处理对样本的影响，还可以物理分离感兴趣的特定样本群进行下游分析（例如，成像和测序）。



图6 根据酶活性对液滴进行分类。

【平台优势及应用总结】
综合效率和应用潜力进行分析，与现有的技术相比，该集成型BD微流控平台的主要优势则是成本低、灵活性高，可实现诸如联合药物筛选和个性化癌症治疗等不同的应用，也可以用于高效进行细胞、胚胎或液滴的多通道分选制备。该技术的进一步优化包括提升微流速度已经降低整体成本，从而应用去其他更多的领域，如组合筛选用于触发细胞命运的最佳生长因子组合，可用于细胞分化、再生医或出生缺陷的预防和治疗等。此外，因为该平台根据自动图像分析分离样品进行特异性分析，有望在基于光学显微镜成像的发育生物学中获得相关应用。
文章来源：
https://www.nature.com/articles/s41596-022-00740-4
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