DNA测序原理（1）——Sanger 法测序

心中u你

最近对DNA测序感兴趣，在网上找了一下原理。很多文章写得都很好，但需要有一定的背景知识，但本人作为非生化类的背景，理解起来比较费劲。于是在油管找，发现有一个视频比较小白向，所以翻译并且截图，就有了这篇文章，希望大牛莫拍。
原视频链接：youtube链接，需要梯子。
Sanger 测序法是第一代基因测序的基本原理，Sanger本人也获得了诺贝尔化学奖。2001年完成的人类基因组框图，采用的也是Sanger法。Sanger法直到今天还在广泛使用，准确率高，被称为基因检测的金标准。所以，要料解DNA测序，首先要了解Sanger法。在这里，我并不涉及具体的化学方程式和公式，只讲原理。
首先，将待测序的DNA扩增，就是复制出很多相同的DNA，准备足够的样本量。↓



接下来，加热，使DNA变性。双链DNA就分离开来，成为单链DNA，只留下下面的单链，称为模板链。↓



将测序引物（primer）和模板链结合，加入引物是因为DNA聚合酶不能重头复制需要前面有一小段起点。



然后将添加完测序引物的DNA平均分散在四个反应容器中。为什么是四个？因为DNA由4个碱基组成，分别是：A、T、G、C。↓



接下来，将DNA聚合酶加入到所有四个反应容器中。↓



继续添加佐料，将四个基本碱基的原料（dNTP），这些原料还是单个的脱氧核糖核酸，加入到每个反应容器。↓



接下来，关键步骤来了，加入特异性ddNTP到反应容器，每个反应容器中只加入一种ddNTP。这里有点复杂，要说一下，什么是特异性ddNTP。ddNTP就是一种变异过的碱基，也有四种，我们姑且称为A*，T*，G*，C*，他也可以和对应的碱基结合，A*-> T, T*-> A, G*->C, C*->G。但是和普通碱基不同的是，当他们和对应碱基结合后，可以终止后续的其他结合，就是DNA的链式反应就结束了。这样就产生很多一边完整（模板单链），一边不完整（因为ddNTP的存在）的DNA分子。如下图，分别加入不同的ddNTP后↓



以黄色的为例，比如这个黄色容器代表加入ddATP（A*）。↓



因为有DNA聚合酶，还有碱基原料，还有特殊碱基A*，在这个容器内开始DNA聚合反应。↓



聚合酶将各个碱基连接到模板链上，直至特殊的A*碱基（带尾巴的黄色块）和绿色块T碱基配对，然后聚合反应终止。这里大家要问了，为什么不和前面的两个绿色结合，直接终止呢？这里要说一句，这里的结合是随机产生的，所以，有一些运气好，直接就和第一个绿色块结合，然后终止了。有些就和第二个绿色块结合，有些就和后面的绿色块结合，反正因为样本足够，按照概率来说，每个对应的绿色块都会有机会和特殊A*碱基配对。下图只是其中一种情况。↓



其他的容器内也在发生相类似的反应。等到反应结束后，将这四个容器内的产物，放置到电泳胶上。↓



通电↓



由于其磷酸盐主链赋予的负电荷，DNA从负极开始迁移，较小的较轻长度的DNA进一步迁移到电泳板的底部。刚刚我们提到过，由于ddNTP随机结合的位置不同，形成的不完整DNA分子，这里不同的DNA分子就被区分出来了，并且分布在不同的位置上。通过荧光标记的方法，就会在胶片上留下记号。↓



最后从底往上读取，就可以得到DNA的顺序。↓



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