PCR实验小问题①——非特异性扩增

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聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction ，PCR)具有特异性强、敏感度高、快速简便、自动化等优点，它可以在一个试管内将我们想要的目的DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，再通过某种技术手段使得实验结果能够肉眼能直接观察和判断，是生物科学史上极具里程碑意义的实验方法。目前来看，最为基础普遍的就是普通PCR技术了，即在反应结束后使用凝胶电泳观察实验结果的技术方法。但是并不是每一次的试验结果都非常的完美简洁，或多或少会出现一些问题，比如非特异性扩增。非特异性扩增就是结果出现与目的条带大小不一致的扩增带，大大小小，几条至十几条都有可能。那么是什么导致了非特异性扩增条带的出现呢？往下看看你就知道啦！


1. 引物。非特异性条带的出现，最大的可能就是引物出现了问题，①引物聚合形成二聚体，会导致100bp左右的位置出现弥散的低亮度条带，②引物与目的DNA序列非特异性互补，即在目的DNA序列上有多个位点均能和引物进行互补配对，导致扩增条带出现多条。可以先小幅减少引物添加量试一下，必要的时候要重新设计引物哦！
2. 模板。模板致使非特异性扩增出现的原因有两种：①模板不纯，样本本身可能有污染，提取核酸过程或实验过程操作不当导致模板或整个反应体系被污染。②模板出现降解，降解后的DNA片段不够完整，自然跑不出我们想要的目的片段。③模板量过大，也会导致非特异性扩增。所以在实验前，我们应该电泳检查模板的完整性和浓度，适当添加模板即可。
3. Mg2+浓度。Mg2+浓度过高会导致大量的非特异性扩增。
4. 反应程序。①循环次数太多的话，目的片段的数目会增加，但是引物非特异性结合，以及聚合酶活性下降导致的非特异性扩增比例也会上升。所以PCR循环次数一般在30个左右较佳。②退火温度过低或时间过短，也会导致引物间结合形成二级结构。
PCR技术说简单也简单，说复杂也很复杂，一点小的不足就很有可能与正确结果擦肩而过，此之谓牵一发而动全身。所以严谨的试验态度非常重要，同样重要的还有优质的试剂与仪器。三狮生物2×Taq PCR Master Mix（Taq酶预混液），科学配比添加了DNA Ploymerase、PCR Buffer及dNTP Mix等多种PCR原料，有含染料与不含染料（电泳时所必需的色素试剂）两种供您选择，您只需要添加模板、上游引物、下游引物和dd水便可进行PCR反应，灵敏度高，特异性强，线性范围广，简单方便，为您的试验保驾护航！

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