PCR技术全面解析：从传统到实时，一窥科研前沿

空白派

　　聚合酶链式反应(PCR)是一种相对简单且广泛使用的分子生物学技术，用于扩增和检测DNA和RNA序列。与传统的DNA克隆和扩增方法相比，PCR只需要数小时，具有快速、高效和特异性强。因为实验需求，目前在PCR基础上改进。大家在实验中还接触到了RT-PCR和qPCR。今天，上海通蔚给大家来介绍一下它们之间的区别。



图1：DNA聚合酶链式反应（PCR原理）

　　PCR


　　聚合酶链反应（PCR，polymerasechainreaction）技术是一种重要的DNA扩增技术，由KaryMullis及同事在20世纪80年代发明，并因此获得诺贝尔化学奖。PCR技术通过反复进行三个核心步骤，使特定DNA区域的数量指数级增加，从而在基因克隆、基因分析、基因诊断、DNA指纹识别等领域发挥着重要作用。

　　PCR实验前需要准备DNA聚合酶、镁离子、核苷酸、引物、待扩增的DNA模板和热循环仪。其中，引物是两条互补序列的短DNA片段，用于指定PCR反应的起始点，引导DNA聚合酶合成新的DNA链。

PCR由三个核心步骤组成：

　　1、变性步骤：双链DNA在高温条件（约93℃）下加热，使其解离成为两条单链。这一步骤的目的是将双链DNA解开，为下一步引物的结合提供单链DNA模板。

　　2、退火步骤：温度降至适合引物结合的温度（通常约55℃左右），引物与单链DNA模板的互补序列结合，形成DNA双链。

　　3、延伸步骤：温度升至DNA聚合酶的最适温度（通常约72℃），DNA聚合酶沿着DNA模板合成新的DNA链，利用反应中的dNTP作为新DNA链的构建单位。

　　PCR的每个循环都包括这三个步骤，循环的次数通常在20至40次之间。完成PCR反应后，通常通过琼脂糖凝胶电泳等方法分析PCR产物，验证扩增是否成功，进一步分析所需的DNA产物。

　　通过PCR技术，可以在几小时内从极少量的DNA样本中扩增出足够的DNA量，为各种基因研究和医学诊断提供了快速、敏感和特异的工具。

　　RT-PCR


　　逆转录PCR（RT-PCR，reversetranscriptionPCR）是PCR技术的一种变形，常用于基因表达分析、病毒检测、RNA病毒的定量等领域。与传统PCR不同，RT-PCR从mRNA模板开始，通过逆转录酶（reversetranscriptase）催化，将RNA转录为互补的DNA（cDNA），然后使用PCR技术扩增cDNA。

RT-PCR的主要步骤包括：

　　1、逆转录（ReverseTranscription）：在这一步骤中，逆转录酶利用RNA模板合成cDNA。逆转录酶可以使用随机引物、oligo(dT)引物或基因特异性引物，以RNA为模板合成相应的cDNA。这个步骤的关键是确保从RNA模板到cDNA的反转录过程高效和准确。

　　2、PCR扩增：在获得cDNA后，将其用作PCR反应的模板，利用PCR技术扩增感兴趣的DNA序列。PCR扩增的过程包括变性、退火和延伸步骤，类似于常规PCR。在变性步骤中，通过高温将DNA解链；在退火步骤中，引物与cDNA结合形成双链；在延伸步骤中，DNA聚合酶合成新的DNA链。

　　RT-PCR技术的应用广泛。例如，在基因表达分析中，研究人员可以利用RT-PCR检测特定基因在不同组织或细胞中的表达水平，以了解基因调控机制。在病毒检测方面，RT-PCR可用于检测病毒RNA，如新型冠状病毒（COVID-19）的RNA，从而帮助诊断感染性疾病并进行疫情监测。此外，在医学诊断中，RT-PCR还常用于检测肿瘤标志物、遗传病突变等。

　　通过RT-PCR技术，我们能够从RNA模板快速、准确地合成相应的cDNA，并对目标DNA序列进行扩增，为基因研究、医学诊断和疾病监测提供了强大的工具。       

　　qPCR


　　qPCR（实时定量PCR，real-timePCR）是一种在DNA扩增过程中实时监测PCR产物的数量的方法，常用于基因表达定量、病原体检测、基因分型等领域。与传统PCR相比，qPCR能够在PCR反应进行的同时实时收集数据，从而准确、快速地定量目标DNA序列。

　　qPCR的基本原理是通过在PCR反应中添加荧光标记的探针或染料，并利用荧光信号的变化来监测PCR产物的累积量。在每个PCR循环中，荧光信号与PCR产物的数量成正比。这种实时监测使得可以在PCR反应进行的过程中即时获取PCR产物的数量信息，而无需等待反应结束。

　　qPCR的步骤与传统PCR类似，包括变性、退火和延伸三个重复步骤。在变性步骤中，高温使DNA解链；在退火步骤中，引物与DNA模板结合形成双链；在延伸步骤中，DNA聚合酶合成新的DNA链。与传统PCR不同的是，在qPCR中，荧光标记的探针或染料能够与PCR产物结合，并通过荧光信号的强度来定量PCR产物的数量。

　　qPCR技术具有许多优点，包括高灵敏度、高特异性、快速、实时性等。由于其高度可靠和灵活性，qPCR已成为生物医学研究和临床诊断中不可或缺的工具。例如，在基因表达定量方面，研究人员可以利用qPCR技术精确地测量特定基因的表达水平，从而了解基因调控的机制；在病原体检测方面，qPCR可以快速、准确地检测病原体的DNA，有助于感染疾病的早期诊断和治疗。

　　通过qPCR技术，我们能够实时监测PCR反应的进程，并准确地定量PCR产物的数量，为科研和医学诊断提供了强大的工具。

5分钟带你认识PCR
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　　上述为大家介绍了PCR、RT-PCR和qPCR区别，选择哪种技术取决于实验目的和需求。 如果只需要确定是否存在特定 DNA 或 RNA 序列，可以选择 PCR 或 RT-PCR；如果需要精确量化起始模板的含量，则 qPCR 是更好的选择。文章来源：PCR、RT-PCR 和 qPCR：哪种技术是你的科研助手？

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