赛默飞细胞计数器，单细胞测序时代的实验室效率加速器

风云

很多朋友可能都知道，浩哥是科研服务行业的务工人员。因此，在日常的工作中会接触到各种各样的科研项目。而从技术变迁层面来看，从几年前开始，测序领域的科研项目就有一个非常明显的转变，那就是单细胞测序技术的使用频率越来越高了。可能很多朋友都还不清楚单细胞测序技术在现代科研中的重要性，还是先简单介绍一下。

单细胞测序技术最核心的能力，是能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性，这对于理解生物体的功能机制和发现更为有效的疾病治疗方法具有重要意义。举个例子，肿瘤靶向药大家应该都多少听过，那为什么同样是肺癌，有的患者就能用靶向药，而有的患者用不了呢（用了也没用，浪费钱）？本质上就是肿瘤细胞的异质性决定的。有些患者的肿瘤组织中大部分细胞都有药物靶点（如特定的突变，或是基因融合事件），但有的患者含药物靶点的肿瘤细胞比例就非常小。而这种差异在组织（细胞混样）层面是没有办法发现的。


是不是觉得很酷炫?但真等你实验室把相关实验开展起来，你就知道这种精细化检测技术的开展有多令人头大了。“客户样本冻融太厉害了！”，“客户样本核酸降解太严重了”，“客户样本活细胞太少了”，“这个样本细胞结团率太高了，只能风险上机”，这些来自实验同事的“抱怨”，我耳朵都听出茧来了......尤其是在实验室没有细胞计数器之前。
比如在测序之前，需要确保细胞样本的活力和纯度，如果大部分都是死细胞，测序的成本就全浪费了。再比如，我们在上机测序前，还需要评估我们样本的细胞捕获效率，比如正常情况下，一个样本都捕获到1万个以上的细胞，但我们的样本只捕获到了3000个细胞，这肯定就意味着样本或者实验操作层面存在问题。那如何分辨我们捕获到了足够的细胞呢？最传统的方法就是在显微镜下，用肉眼去数。相信大家光想想都能感受到这种方法的痛苦吧。而细胞计数器就是一项能够准确评估细胞的活力和分离度神器。
让我印象深刻的一幕，是早期的一个食管癌单细胞项目，因为客户对于样本的前期处理要求不熟悉，导致大部分到达实验室的样本都发生了降解，但因为这批样本没有其它备份了，所以只能在中间挑出相对上机风险较小的样本。这可把实验员小姐姐们给累坏了，最后在她们的苦苦“哀求”下，老板终于托关系找附近的一家公司借了台细胞计数器过来，才最终让这个项目能顺利的进行下去。


这也是为什么我一生物信息学背景的科研民工，对细胞计数器有这么深的印象。说到这儿，就多提两嘴，细胞计数器的诞生时间其实并不短，其发展经历了几个重要的阶段，从最早的血球计数板，到流式细胞仪，再到现代的基于图像的细胞计数器。在图像细胞术的兴起与现代自动化技术的融合下，相关设备的检测精度也得到了飞速的发展。


细胞计数的重要性

传统的手动数细胞的方式，确实容易让人崩溃，一次只能数上百个，但对肉眼和人脑都极具挑战。但抛开方式不谈，保证细胞能够数得准确，却又是十分重要的，细胞计数不正确，除了可能导致检测目标完整度缺失，加大下游实验的误差外，还有可能在治疗监测层面直接影响到治疗效果的评估和患者的健康监测。可能有朋友会说了，不就是数个数，有这么难吗？

你别说，还真有这么难！我已经不止一次听到我们的实验同事对此的抱怨了。这里的核心原因在于有很多因素都会对细胞计数的准确性产生影响。比如细胞悬液的制备过程中，细胞没有充分混匀，就有可能会导致计数时的细胞分布不均匀。又比如细胞碎片和非细胞物质的存在可能会被错误地计入细胞计数中，导致细胞数量被高估。这就可能会影响对细胞生长和增殖的评估。再比如对样本中细胞活力的判断，如果把死细胞也纳入计数，就可能会严重影响后续的分析结果。而目前主要对于细胞活性的判断，主要还是基于染色的原理，因为活细胞的细胞膜完整，能够排斥染料。而上述的这些常见问题，在细胞计数器的帮助下，通常都能够得到很好的解决。这也是为什么做单细胞的实验室里，实验人员需求呼声最高的设备就是细胞计数器。


那细胞计数器具体带来的是什么呢？废话不多说，主要是以下几个方面:

• 自动化计数的功能，能够自动完成细胞的计数和活力评估，减少了人为错误和重复工作。
  
• 节省时间，细胞计数器通常能够在几分钟内完成细胞计数。
  
• 最大限度保护样本，一些细胞计数器设计为非侵入式或低侵入式，这意味着它们在计数过程中不会破坏细胞，从而减少了对细胞样本的需求。
  
• 标准化操作保障了良好的重复性。
  

如何选择与单细胞测序配适的细胞计数器

其实当时实验室采购细胞计数器的时候，还是斟酌了良久，是省点钱选个性价比高的？还是直接一步到位整台还能测量细胞大小、形状和颗粒度等参数的？或者是不是考虑长远一点，选台可以同时处理多个样本加速流程的？最后你猜怎么着？我给公司的建议是，不如直接抄作业！当时由于业务的需求，跟单细胞测序中的龙头10x Genomics的员工也有很多交流，发现他们其实也很看重细胞核计数的结果。我就刻意去搜了一下10x Genomics的官网，发现在如何进行细胞计数的页面，它们提供了赛默飞Countess系列设备的操作指南。


在进一步的调研后，我果断给公司推荐了赛默飞Countess 3这款全自动细胞计数仪。毕竟相对而言，个人认为细胞计数器的测量精准度是最重要的，这可能对后续的实验设计与结论起到决定性的影响。而在准确度层面，Countess 从二代机到现在带AI功能的3代机，都与10x genomics进行了深度合作，得到了业界大佬对其性能的认可，还是靠谱的。


由于从组织样品中提取细胞核，往往带来比较多的细胞碎片，计数的准确度面临的挑战要比细胞来源的大。经过样本测试，Countess 3 新版软件在分离细胞核计数上，其准确度达到了要，CV值范围基本控制在-4.8%至6%之间。


不仅是自动调节亮度，Countess 3的不同光照模式，在某些情况下，往往能发挥奇效。比如对于有细胞壁的植物细胞，我们往往都是通过抽提细胞核的方式来进行。我们就发现对比明场模式，其实荧光模式对分离细胞核计数就更准确。尤其是从组织中提取细胞核，往往会带来比较多的细胞碎片，计数的准确度面临的挑战要比细胞来源的大。而在荧光模式下，我们得到的CV值范围基本都在10%以内。而在细胞汇聚率的计算上，Countess 3的表现同样突出，无论是批次间还是仪器间的CV值，基本都能控制在5%以内，表现的非常稳定。


当然价格也是一个考量的关键因素。Countess 3有个经济实惠的隐藏属性——它可以使用重复计数板。询价时候也发现，现在Countess 3的价格下落了，是入手的合适时机。
相信未来科研的大趋势，会进一步往微观精细化方向发展，相信单细胞测序技术会在相当一段长的时间内占据核心的主导地位，而细胞计数仪在相关的检测领域无疑是一项非常全能的好帮手。最后祝各位科研工作者都能happy research!



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