菌液PCR实验原理及操作步骤

幸福侠侣

不必提取目的基因DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增。称为菌液PCR，菌液PCR常用于检测菌落是否携带目标质粒。


菌落PCR步骤：
1) 设计引物来检测插入片段；
2) 以裂解细菌的上清液为模板，实验室一般选择挑取单克隆为模板，或摇培后取菌液做模板，建立标准反应体系 (引物，dNTPs，聚合酶，buffer) 后直接进行PCR检测；
3) 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物以分析扩增片段长度是否符合预期。
菌落PCR的第一步，也是最重要的一步是设计引物。引物设计有3种策略：
1)插入片段特异性引物 (Insert-specific)；
2)载体特异性引物 (Backbone-specific)；
3)定向特异性引物 (Orientation-specific)。
1.片段特异性引物
插入片段特异性引物设计用于退火至插入片段特异性序列。阳性条带为重组成功的转化子，阴性无条带为重组失败。但该类型引物有个弊端：阳性条带只能判断出是否存在特定的目的片段，但不能确定片段是否插入在质粒上，或片段在质粒上是否处于正确的方向。
2.载体特异性引物
载体引物用于退火到插入片段两侧的载体位点，阳性克隆转化子会检测出插入基因长度的条带。这种类型的引物可以判断插入片段大小是否正确，以及它是否成功插入到载体上，也非常适合筛选同一载体但包含不同插入片段的克隆。缺点是该引物不能确定插入片段的方向正确与否。
3.定向特异性引物
平末端克隆时，需要确定插入片段的方向，则可以考虑设计定向特异性引物。其中一条引物退火到插入片段两侧，另一条引物退火到插入片段上。
注意事项：
1.EP管和枪头等耗材要先进行高压蒸汽灭菌，去除DNA酶（无酶无菌耗材除外）。
2.加菌液模板时需在超净台中进行，防止挑取的单菌落污染其他杂菌。
3.由于实验过程存在致癌试剂，实验操作人员严格穿戴实验服和手套。保障自身安全。

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