基因测序和液态活检的关系？

笑看风云

在医疗中，基因测序是否包含液态活检？
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长长的路

说到肿瘤，我们常常避之不及。世界卫生组织提出：1/3的癌症可以预防；1/3的癌症可以早期发现并根治；余下的1/3才是利用现有的治疗手段延长生命、减轻病痛、改善生活质量。可见，面对肿瘤这一恶疾，早期的预防与诊断甚至比治疗更加重要。
液体活检是一种非侵入性的生物标志物检测技术，2013年被定义为一种早期癌症检测方法。液体活检常用于早期癌症的检测，具有在症状出现之前发现癌症的优势。液体活检也被用于癌症晚期治疗决策。与肿瘤确诊的金标准“组织活检”相比，液体活检具有检测样本灵活多样、患者依从性高、重复性好等优势，对肿瘤早期诊断与动态监测具有重要意义。与传统的血清学肿瘤标志物检测相比，液体活检的检测更具靶向性，有利于促进肿瘤诊治的精准化。



液态活检与组织活检优劣势特征对比

液体活检与肿瘤诊断

液体活检顾名思义，是对身体中“液体”的检测，液体活检的检测样本可以是血液、尿液、唾液或脑脊液等含有肿瘤相关生物标志物的体液，其中血液是最常见的样本。液体活检常用的生物标志物包括循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）、循环肿瘤DNA（ circulating tumorDNA，ctDNA）以及细胞外囊泡( extracellular vesicles，EVs) 。



血液中包含的肿瘤相关物质，包括循环肿瘤细胞（CTCs）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、循环肿瘤RNA（ctRNA）以及肿瘤分泌的外泌体（Exosomes）；通过荧光原位杂交或高通量测序（NGS），我们可以从血液中分离出这些带有肿瘤标记的物质，并进一步对肿瘤的突变特征进行分析。

循环肿瘤细胞（CTC）

循环肿瘤细胞（Circulating Tumor cell，CTC）是指从实体瘤中脱离，并进入外周血液循环的肿瘤细胞。
肿瘤在生长发育过程中，会不断向外播散具有侵袭性的肿瘤细胞或细胞簇，它们是肿瘤派出开疆拓土的侦察兵，身肩寻找下一处合适“土壤”的任务。不过，这种探索是艰巨的，大部分游离的肿瘤细胞最终都会死亡；而那些成功抵达了新大陆的小部分幸存者，则可能最终发展成一处新的转移病灶。
这种播散-转移行动很早就已经暗中开始了，有些甚至发生在能被检测的病灶出现之前。因此，对血液中这些循环肿瘤细胞进行特异性检测，有助于我们在早期发现体内肿瘤的踪迹，并进行治疗干预。



肿瘤的转移-定植过程：肿瘤组织播散游离的肿瘤细胞进入血液，通过血管网络渗入其他组织，定植、增长，并再次转移的过程。

CTC的产生有两种机制：
1. 通过主动灌注，上皮细胞向间充质细胞转化(EMT)；
2. 通过从原发性肿瘤被动脱落；

血液中检测到的CTC可以是活性或凋亡的，但只有活性CTC对评估癌症的转移具有意义。CTC的半衰期为1.0～2.4 h，这一特性决定CTC的检测结果具有较强的实时反映能力，可以作为动态监控的一种靶标物。基于这一特性，外周血中也能检测到破碎或凋亡的CTC，使得一些CTC标志物的检测结果存在一定的底噪，因此对CTC检测富集技术要求较高，CTC的附件检测技术要求满足几个条件：
①能够分离高水平特异性的CTC；
②可处理少量CTC(每10^9个血细胞少于100个靶细胞)；
③在全血样本中表现出高性能，并通过临床验证；
④能对异质性CTC亚群进行分类，区分不同转移潜能的癌细胞；
⑤允许释放活细胞，以便进行下游分析；
由于CTC在血液中的自然浓度极低，CTC检测方法分为免疫分析、分子分析和功能分析，均要求首先进行CTC的富集，以便将检测液中的CTC浓度(比血液中)提升几个数量级，目前主要的CTC富集捕获技术见下表：



CTC富集捕获技术

目前CTC检测在应用中面临的挑战和可能的解决方案如下：



CTC在临床面临的挑战及可能的方案

循环肿瘤DNA（ctDNA）

循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA）是肿瘤细胞破裂后，释放到组织中的DNA碎片。正常生理情况下，坏死和凋亡细胞会被单核- 巨噬细胞系统清除，释放出的cfDNA 非常少。而肿瘤组织生长迅速，坏死和凋亡细胞所占比例增高，加上肿瘤患者的免疫功能紊乱，使得进入外周血的cfDNA 相对较多。尽管如此，ctDNA 占总cfDNA 的比例仍不足1%。目前分离ctDNA 主要是使用商品化的试剂盒，分离方法主要采用微柱吸附法和磁珠吸附法。
与循环肿瘤细胞（CTC）检测相似，ctDNA检测同样可以在早期诊断出肿瘤的发生。癌症患者的血浆中检测到的cfDNA长度范围为90～150 bp，比常规cfDNA片段短。除此之外，ctDNA所携带的肿瘤遗传信息，也有助于肿瘤分子图谱的构建。



循环肿瘤DNA对肿瘤耐治疗耐药性的检测。在治疗压力下，体内肿瘤可能会向着耐药的方向演化；通过循环肿瘤DNA检测对体内肿瘤细胞基因型进行分析，我们可以动态监控肿瘤克隆型变化，监控耐药性的产生，以便及时调整治疗策略。

目前检测ctDNA的方法主要有：



ctDNA相关检测技术介绍

液体活检中ctDNA的检测主要面临的挑战有：①ctDNA含量有时极低；②选择正确的癌症特异性基因组畸变；③样本中突变片段数目的精确量化。
细胞外囊泡（EV）

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，是细胞分泌的携带各种核酸和蛋白质的一种脂质囊泡，直径从40nm到1000nm不等，可通过其获取肿瘤相关信息。
胞外囊泡主要由微囊泡（Microvesicles,  MVs）和外泌体（Exosomes, Exs）组成；
微囊泡是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡，直径约为100nm – 1000nm。外泌体由细胞内的多泡小体（multivesicular bodies）与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，直径约为40nm - 100nm。外泌体在细胞间通讯和组织微环境调控方面发挥重要的作用，是多种生物大分子的运载体；目前已在外泌体内检测到92897种蛋白质、584种脂质、4934 种微RNA（microRNA，miRNA，又称miR）和27642 种mRNA。此外，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）与环形RNA（circular RNAs，circRNA） 也相继在肿瘤患者外泌体中检测到。因此，作为一种生物标志物，外泌体及其内容物为肿瘤的研究和临床诊疗开辟了一条新的途径。



细胞外囊泡形成过程

外泌体相关检测目前包括分离纯化、物理特性鉴定及下游功能研究的分析。研究肿瘤患者体液外泌体，必须从大的EVs及正常细胞外泌体中分离出来。需要有效的方法捕获并进行定量分析。外泌体的分离纯化技术主要包括超速离心法、密度梯度离心法、色谱法、免疫磁珠法等，在正常细胞或肿瘤细胞培养基上清液、血液、唾液等体液中检测并分离、纯化外泌体。外泌体的物理特性鉴定技术主要包括电镜观察、动态光散射及纳米微粒追踪分析以及可调谐电阻脉冲传感检测技术。外泌体蛋白质的分析技术主要有酶联免疫吸附测定（ ELISA）、蛋白印迹和质谱分析等；核酸的分析主要有二代测序、基因芯片、qPCR等方法。
与ctDNA和CTC相比，外泌体在分离、分析灵敏度和稳定性方面受限，但具有多种潜在优势。外泌体在包括血液、尿液和脑脊液等多种体液中广泛分布，数量丰富，具有较好的稳定性，因此比ctDNA和CTC更易得到理想的检测浓度。外泌体作为定量和定性信息的来源时，可以告知恶性疾病和肿瘤负担的存在。大量研究表明，癌细胞衍生的外泌体含有能反映癌细胞起源的特异性核酸和蛋白质。
目前对于外泌体的研究正如火如荼，相信在不久的将来我们会了解外泌体在健康及疾病中更多的功能。不可否认，目前外泌体研究的整个流程中成本都很高，从一定程度上限制了它的研究和临床应用，但是相信随着外泌体标准化分离提纯及检测平台的建立，外泌体在肿瘤的诊断和治疗领域将具有非常广阔的应用前景。
液体活检的出现是对目前已有肿瘤检测体系的完善。目前对应的检测方法可详见表5，液体活检在早期即可发现体内肿瘤的踪迹，是肿瘤早期筛查的重要手段。此外，相对于直接取自肿瘤组织的组织活检，液体活检的材料来源于血液，创伤性更小且便于实时监控，在肿瘤辅助诊断、疗效评价、耐药性以及预后复发的监控中也发挥了积极作用，是一种重要的肿瘤诊疗技术。



液体活检主要分析技术



液体活检主要分析技术



液体活检主要分析技术