新技术助力“外泌体”液态活检

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外泌体参与生命众多生物学过程，在许多疾病中是重要的标志物。
近日，著名杂志《Nature communation》发表了瑞典乌普萨拉大学的研究人员的新技术：通过抗体-DNA耦联物，结合第二代测序技术（NGS）检测外泌体的表面蛋白组成。
这项新技术被称为“近端依赖条形码分析”（proximity-dependent barcoding assay，PBA）。




1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。
外泌体：特指直径在40-100nm的盘状囊泡，可由树突细胞、淋巴细胞、血小板、肥大细胞 、内皮细胞 、成纤维细胞 、间充质干细胞和肿瘤细胞等不同细胞类型脱落释放，在大多数体液如外周血、尿液、唾液、腹水、羊水、乳汁、脑脊液、关节液、支气管肺泡灌洗液等体液中可检测到。
外泌体主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。


目前，众多的研究表明，外泌体可携带多种蛋白质、脂质、mRNA和miRNA，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生、免疫反应和肿瘤细胞生长的过程。
外泌体介导的细胞间通讯主要通过以下几种方式：
1、外泌体膜蛋白可以与靶细胞膜蛋白结合，进而激活靶细胞细胞内的信号通路。
2、在细胞外基质中，外泌体膜蛋白可以被蛋白酶剪切，剪切的碎片可以作为配体与细胞膜上的受体结合，从而激活细胞内的信号通路。
因此，通过检测外泌体所携带的信号分子，有望用于疾病的诊断和检测，特别是在肿瘤标志物检测方面。




研究者首先制备了PBA探针，将抗体和DNA寡核苷酸耦联构成可以识别外泌体膜蛋白的探针。
DNA寡核苷酸序列中含有一段8核苷酸的序列，该序列为UMI序列。
研究者称为molecule Tag，其被用来指示PCR后不同蛋白的含量。


探针制备好后，将待检外泌体与PBA探针混合，探针上的抗体特异性识别外泌体膜上蛋白，随即清除未识别的PBA探针，经PRC扩增后，最终经测序来识别外泌体上的蛋白质。


为确定PBA能正确识别蛋白质复合物，研究者首先用链霉亲和素(STV)与生物素化寡核苷酸结合。
通过不同比例孵育，经单独检测和混合检测确定该探针的准确性，结果显示，该探针准确性极高。
此外，经anti-CD9和anti-CD63两个PBA探针检测外泌体中CD9和CD63含量再次验证了该探针的稳定性。


随后，研究者利用该技术分析了不同来源外泌体表明蛋白的含量。
外泌体来自于18位不同的健康志愿者，取自血清和精液。此外还检测了人不同组织来源的肿瘤细胞系，如BLC21, U87MG、A549、HCT116、PC3等。
通过对比外泌体相关蛋白含量的水平，为临床诊断提供有价值的信息。






外泌体包含多种蛋白质和遗传物质，广泛分布于不同体液中，并且半衰期较长。
所以，外泌体可作为一种无创或微创的非侵入疾病诊断手段，一定条件下能够代替组织活检减轻患者的痛苦，提高疾病早期诊断率。
本篇研究为外泌体检测提供了有力的工具。


参考文献：
Simons M, Rapose G. Exosmes -vesicular carriers for intercellular communication [J]. Curr Opin Cell Biol,2009,21(4):575-581.
https://mp.weixin.qq.com/s/xuZmiejCQbi5wO0UhWwUIA

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