荧光显微镜与FISH荧光原位杂交技术

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FISH荧光原位杂交技术与荧光显微镜
荧光原位杂交技术（FISH）
荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）是临床病理检测中广泛运用的一种分子细胞遗传学诊断技术，其原理是用荧光染料直接或间接标记的DNA核酸探针与待测样本中的DNA核酸序列按照碱基互补配对的原则进行杂交，然后通过荧光显微镜观察荧光信号位置、数量等来判断待测序列的缺失、扩增及易位等情况。



FISH荧光原位杂交原理（来源NIH）

目前这项技术已经广泛应用于染色体精细结构变异分析、动植物基因组结构研究、人类产前诊断、肿瘤遗传学、基因组进化研究、病毒感染分析等众多领域。在临床中应用较多的有以下几种：
（1）乳腺癌Her-2/neu基因检测，乳腺癌细胞中Her-2/neu基因的扩增一般预示着患者预后较差，应用针对该基因异常扩增的靶向治疗药物，能特异性地控制癌细胞的生长，改善病人预后。Her-2/neu扩增是靶向药物使用的关键指标，而检测Her-2/neu扩增的金标准即为FISH



MC50-S拍摄的两种Her-2检测结果（红多于绿表示扩增，要用药）

（2）宫颈癌TERC基因检测，准确区分宫颈细胞高度癌前病变与低度癌前发育异常，灵敏度和特异性超过百分之90；
（3）膀胱癌3、9、7、17号染色体数目异常检测，使用样本为尿液，属于无创性早期诊断；
（4）产前检测，13、18、21、X、Y染色体数目异常检测，及时发现异常胎儿并判断染色体疾病种类；
（5）血液肿瘤检测，通过FISH检测特定基因，可准确预测预后及指导临床个性化治疗。
FISH技术本质是对遗传物质进行检测，所使用的标本类型可以包括1、遗传病：外周血、羊水、绒毛、胎儿脐带血，或羊水和绒毛的间期细胞；2、血液病：外周血或骨髓的染色体或间期细胞；3、实体肿瘤（包括骨髓活检）。理论上讲，任何含有足够癌细胞或DNA的组织、细胞或体液（如胸水、腹水等）标本都可进行相应的基因状态检测。
总体而言，FISH可以检测100kb左右的异常，远远高于明场下核型分析的分辨率，同时由于是原位杂交，可以直接体现异常细胞百分比，对于临床后期治疗有着很强的指导作用，且耗时短，操作简单，已逐步成为临床检测、预后监测、用药指导等不可或缺的技术手段。
FISH荧光原位杂交的成像挑战
（1）荧光信号点弱，需要大功率荧光光源激发。由于不适当的包埋、固定或探针本身等因素，需要使用高亮度光源才能对荧光探针进行激发。传统使用汞灯作为荧光光源，在亮度等方面具有一定的优势，但同时存在热损伤、寿命短、需要预热等待、维护复杂等问题，目前已逐步被大功率LED光源所取代。明美系列大功率LED荧光光源克服汞灯的缺点，光谱覆盖大部分探针激发波段，同时具有亮度高、低光毒性、低热损伤、过万小时寿命、即开即用等特点，是FISH检测中理想的荧光光源。



荧光光源

（2）容易有背景噪声干扰，需要高截止性能的滤光片组。在使用高亮度荧光光源情况下，使用长通滤光片或截止性能差（OD截止深度低）的滤光片，会导致背景噪声比正常情况高，而所需要的探针信号会被淹没在噪声中，从而造成假阳性或假阴性结果。明美荧光激发块和研究级荧光显微镜使用进口滤光片，根据需要可选择不同窄带滤光片或双通滤光片，可有效消除背景荧光干扰，获得高信噪比的荧光成像。



进口CHROMA滤光片，具有高透光率和优良的截止性能

（3）不同通道下探针信号叠加的挑战，包括荧光显微镜本身性能及FISH图像处理软件功能。
对于荧光显微镜需要①具有多荧光通道，例如常规的FISH检测需要使用DAPI、FITC、TexasRed分别对细胞质、蛋白质（抗体）、细胞骨架进行标记，就要求荧光模块至少具有三个通道；②机身稳定及调焦机构的精细程度，FISH检测通常在100倍物镜下进行，信号点可能在不同的焦面，就需要多次微调焦面以得到全部的信号点，高倍下的操作要求显微镜具有良好的刚性及精细的调焦行程，以避免图像漂移和遗漏信号点。
常用的探针荧光染料


对于软件需要①能对信号点进行增强及将背景荧光消除，部分探针信号点亮度较弱，需要通过软件对其进行增强，以避免被背景荧光覆盖；②单通道下的图像叠加，信号点可能位于不同焦面，需获得多张图像进行叠加合成以得到该通道下目标区域全部的信号点；③多通道的图像叠加，得到的FISH结果是需要对不同探针的位置、数量等情况进行统计，需要软件将不同通道下得到的图像叠加在一起，需要保证叠加时不漂移，避免信号点错位、重叠等造成结果失真。
明美研究级荧光显微镜配备6孔落射荧光模块，可按需配置6个激发通道，采用进口主机，机身稳定刚性高，针对FISH图像处理，明美开发了专业的处理软件，具有信号增强、背景去除、通道叠加、出具报告等强大功能。





叠加合成图片

（4）荧光成像要求相机灵敏度高。FISH探针信号往往都是点状或成簇分布，要求显微成像相机有较高的灵敏度，同时具有良好的噪声控制，这样才能在背景荧光中获得所需的点状/簇状探针信号。明美MC50-S等荧光显微相机，像元尺寸超过3μm*3μm，具有优良的弱荧光捕获能力，同时具有超低的读取噪声，可保证FISH检测中获得良好的荧光成像。
（5）FISH高倍检测下对物镜成像性能的要求。FISH检测对象是遗传物质上的信号点，通常使用40-100倍物镜进行成像，需要能分辨出点状或簇状的探针信号，尤其是在双通等情况下，成对信号点之间的距离很小，这对于物镜的分辨率就提出很高的要求。明美MF43-M采用高品质半复消色差荧光物镜，具有高透光率与高数值孔径，成像效果好，分辨率高。

明美方案
（1）完整FISH荧光原位杂交成像，配套FISH分析系统方案
推荐：荧光显微镜MF43-M（医疗器械型号）+显微相机MC50-S/MS23+荧光光源MG-100/MG-120/MG-200


▪ 配备6孔落射荧光模块与大功率LED荧光光源，使用方便激发效果好
▪ 高品质Chroma滤光片，截止深度大，信噪比高，参数可按需配置
▪ 高性能主机架，荧光透过率高，低杂散光，机身稳定，调焦准确顺滑
▪ 高数值孔径半复消色差荧光物镜，荧光信号强，成像清晰
▪ 高灵敏度与低读取噪声荧光显微相机，弱荧光成像效果好
▪ 获医疗器械注册的专业FISH图像分析处理软件，使用方便，功能强大
（2）已有四大品牌无限远显微镜，升级FISH分析系统
推荐：四大品牌无限远显微镜 + 明美六孔ref="https://www.mshot.com/list/72.html">荧光模块 + 荧光光源MG-100/MG-120/MG-200 +显微相机MC50-S/MS23


▪ 适合四大品牌无限远光学显微镜升级
▪ 专业六孔荧光模块，激发块可按需选择，扩展性强
▪ 方便易用，超长寿命的LED荧光光源
▪ 高灵敏度的FISH专用显微镜相机，搭配专业FISH图像分析处理软件
（3）已有四大品牌荧光显微镜，升级LED荧光光源
推荐：MG-100/MG-120/MG-200


▪ 可匹配四大品牌主流荧光显微镜
▪ 覆盖荧光激发光谱，亮度高，激发效果稳定
▪ 触屏控制器，操作直观简单
▪ 寿命长，即开即用，维护简单
▪ MG-200液冷散热，提供更接近汞灯的光强，尤其加强G波段
明美是国家高新技术企业，创立至今已20年，专注于显微镜以及显微成像系统产品的研发、生产和销售，致力于显微成像领域的自动化、数字化、智能化；明美迄今已为全球10万+的用户提供过产品以及服务;明美曾屡获国家创新基金支持，被广东省科技厅认定为显微成像工程技术研究中心。
公司以品质谋发展，以服务为宗旨，连续11年获守合同重信用企业认证，已通过ISO9001质量管理体系、ISO14001环境管理体系、ISO13485医疗器械质量管理体系和知识产权管理体系认证，拥有二类医疗器械生产资质，获得近百个专利和软件著作权。
明美总部位于广州，在全国20余个大中城市均设有服务网点，提供完善的专业服务。
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