微生物检测方法验证和确认概述

临床医师

药品微生物检验方法主要分两种类型：定性试验和定量试验。定性试验就是测定样品中是否存在活的微生物，如无菌检查及控制菌检查。定量试验就是测定样品中存在的微生物数量，如微生物计数试验。
由于微生物试验本身的变异性，如微生物检验方法中的抽样误差、稀释误差、 操作误差、培养误差和计数误差都会对检验结果造成影响，以及微生物在测试样品中的分布的不均一性，微生物方法的验证较理化方法的验证更为复杂。
药典微生物方法是经过验证的，只需要按照药典要求进行方法适用性测试。
随着微生物学的技术发展，制药领域引入了一些新的微生物检验技术，如脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。这些方法与传统检查方法比较，简便快速或具有实时或近实时监控的潜力。监管机构规定，使用非药典规定的检验方法（即替代方法）时应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。
药品微生物检验替代方法的验证参数见下表。


                                            1-微生物定性替代检验方法的验证
1、专属性
微生物定性检验的专属性是指检测样品中可能存在的特定微生物种类的能力。当替代方法以微生物生长作为判断微生物是否存在时，其专属性验证时应确认所用培养基的促生长试验，还应考虑样品的存在对检验结果的影响。当替代方法不是以微生物生长作为判断指标时，其专属性验证应确认检测系统中的外来成分不得干扰试验而影响结果，如确认样品的存在不会对检验结果造成影响。采用替代方法进行控制菌的检验，还应选择与控制菌具有类似特性的菌株作为验证对象。
2、检测限
微生物定性检验的检测限是指在替代方法设定的检验条件下，样品中能被检出的微生物的最低数量。由于微生物所具有的特殊性质，检测限是指在稀释或培养之前初始样品所含有的微生物数量，而不是指检验过程中某一环节的供试液中所含有的微生物数量。
检测限确定的方法是在样品中接种较低浓度的试验菌(每单位不超过5cfu)，然后分别采用药典方法和替代方法对该试验菌进行检验，以检出与否来比较两种方法的差异。试验菌接种量须根据试验而定，以接种后采用药典方法50%的样品可检出该试验菌为宜。检测限验证至少应重复进行5次。对于同一种试验菌可釆用卡方检验来评价两种方法的检测限是否存在差异。
3、重现性
重现性可视为微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力。方法使用者应优先测定该验证参数。在样品中接种一定数量的试验菌（接种量应在检测限以上），采用药典方法和替代方法，分别由不同人员，在不同时间，使用不同的试剂（或 仪器）进行检，采用卡方检验(f)来评价两种方法的重现性是否存在异。验证过程中，应关注样品的一致性。
4、耐用性
与药典方法比较，若替代方法检验条件较为苛刻，则应在方法中加以说明。替代方法与药典方法的耐用性比较不是必须的，但应单独对替代方法的耐用性进行评价，以便了解方法的关键操作点。
                                        2-样品中微生物定量检验方法的验证
1、准确度
微生物定量检验的准确度是指替代方法的检验结果与药典方法检验结果一致的程度，通常用微生物的回收率（％)来表示。
准确度验证的方法：制备试验菌的菌悬液，菌悬液的浓度应选择为能够准确计数的最高浓度，然后系列稀释至较低浓度（如小于10cfu/ml)。例如，菌落计数平皿法的替代方法，在制备髙浓度菌悬液时其浓度是103 cfu /ml，系列稀释至100cfu/ml。每个试验菌应至少选择5个菌浓度进行准确度确认，替代方法的检验结果不得少于药典方法检验结果70% ，也可以采用合适的统计学方法表明替代方法的回收率至少与药典方法一致。当替代方法的回收率高于药典方法时，有必要结合专属无菌检查方法适用性。
2、精密度
精密度验证的方法是：制备试验菌的菌悬液，齒悬液的浓度应选择为能够准确读数的最高浓度，然后系列稀释至较低浓度（如小于10cfu/ml)。每个试验菌选择其中至少5个浓度的菌悬液进行检验。每一个浓度至少应进行10次重复检验，以便能够采用统计分析方法得到标准偏差或相对标准偏差。
3、专属性
专属性验证应证明当样品中存在一定数量的试验菌时，通过平皿法检验，能够检出试验菌，而样品的存在不会对结果造成影响。专属性验证时，应能够设计出可能使替代方法出现假阳性的实验模型来挑战替代方法。当替代方法不依赖微生物生长出菌落或出现混浊就可以定量时(如不需要增菌或在1〜50cfu范围内就可直接测定菌数的定量方法），以上验证方式就显得更为重要。
4、定量限
定量限验证的方法是：在检验范围的低限制备5 份不同含菌浓度的菌悬液，每份菌悬液分别用药典方法和替代方法进行不少于5 次检验，采用统计方法比较替代方法的检验结果与药典方法结果的差异，从而评价替代方法的定量限。
5、线性和范围
线性验证时必须覆盖能够准确测定的所有浓度范围。每株试验菌应选择至少5个浓度，每个浓度至少测定5次。根据以上实验数据，以检验结果为因变量，以样品中微生物的预期数量为自变量进行线性回归分析，计算相关系数r。替代方法的相关系数不得低于0.95。
微生物定量检验的范围是指能够达到一定的准确度、精密度和线性，检验方法适用的髙低限浓度或数量的区间。
6、重现性
在样品中接种一定数量的试验菌（接种量应在定量限以上），采用药典方法和替代方法，分别由不同人员，在不同时间，使用不同的试剂（或仪器）进行检验，对检验结果进行统计分析，以相对标准偏差（RSD) 来评价两种方法的重现性差异。
7、耐压性
替代方法与药典方法的耐用性比较不是必须的，但应单独对替代方法的耐用性进行评价，以便了解方法的关键操作点。
                                        微生物检测方法确认概述

                                                    1-无菌检验方式适应性
使用药典方法进行产品无菌检查时，应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。
薄膜过滤法取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。加硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。置规定温度培养，培养时间不得超过5天，各试验菌同法操作。
直接接种法取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙酵酸盐流体培养基6管，分 别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接种法培养基用量要求的胰酪大豆胨液体培养基6 管，分别接入小于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，置规定的温度培养，培养时间不得超过5天。
结果与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验。
                                                    2-非无菌产品微生物限度检查
计数方法验证的原理主要是确认样品有无抑菌性，即确认检验样品中的微生物能否在此培养基中正常生长。通常方法是在检验样品中加入代表类型的菌种（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉，加菌量应不大于100cfu），各试验菌应逐一进行验证试验。如果供试品对微生物生长具有抑制作用则需要采用适当方法消除抑制作用。按药典要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用各供试液。计数方法适用性试验中，采用平皿法或薄膜过滤法时，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5〜2范围内；采用MPN法时，试验组菌数应在菌液对照组菌数的95%置信限内。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。
                                                    3-控制菌检查方式适用性
控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检査供试品中是否存在特定的微生物。应根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应试验菌株。
按控制菌检査法取规定量供试液及不大于100cfu的试验菌接入规定的培养基中；采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加入试验菌，过滤后，注入规定的培养基或取出滤膜接入规定的培养基中。依相应的控制菌检査方法，在规定的温度和最短时间下培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征。如果上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性并重新进行方法适用性试验。
                                                      4-消毒剂效力验证
消毒剂指应用于表面可以杀灭细菌、真菌、病毒，但是并不一定能够杀灭它们的孢子。消毒剂常被分为高效、中效、低效消毒剂。为了避免洁净区的任何污染并保持所要求的高水平的洁净度，应制定适当的常规清洗消毒程序，同时应进行环境监控来证实环境持续受控。
国内外发布的消毒剂效力验证的指南如美国药典通则1072，国内主要包括消毒技术规范和消毒与灭菌效果的评价方法与标准(GB 15981-1995)。
消毒剂效力验证的主要内容包括实验室和现场阶段。实验室阶段考察消毒剂使用浓度和作用时间下对代表细菌的杀灭效果以确定消毒程序参数，并根据应用实际环境下的不同材质的载体，进行模拟试验。现场阶段考虑现场消毒程序验证，对于消毒房间和取样点进行风险评估并考察消毒程序的重现性。同时考虑消毒剂有效期考察：对使用新消毒剂前后环境微生物的检出频率和数量进行统计学评估。
实验室对消毒剂的杀菌效力测定方法常有定量悬浮试验法、载体浸泡定量试验法、表面试验法、工作液直接接种法等多种试验方法。效力验证使用的挑战菌种应具有代表性和普遍性。常用的标准菌种验证用菌种包括金黄色葡萄球菌、铜绿色假单胞菌、沙门氏菌、大肠埃希菌、枯草杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；环境分离菌最具个体环境的代表性，在效力验证中应使用环境分离菌进行挑战试验。

1、定量悬浮试验
定量悬浮试验是评价消毒剂杀菌效果常用的一种定量试验方法，将定量的挑战菌悬液加入确定浓度的消毒剂溶液中，作用规定的时间。经中和剂去掉残留的消毒剂影响后，定量接种于平皿上，倾注培养基，经培养后计算其菌落数。与未经消毒剂作用的对照菌液平皿计数相比较，计算出杀菌率。
杀菌率＝[（对照组平均活菌数-试验组活菌数）÷对照组平均活菌数]×100％
2、载体浸泡定量试验
载体浸泡定量试验原理与定量悬浮试验相类似，本试验先将指示菌悬液定量接种到载体上，再将载体加入到消毒剂中作用至约定时间后，把载体取出加入中和剂内中和，定量接种于平皿上，倾注培养基，经培养后计算其菌落数。与未经消毒剂作用的对照菌液平皿计数相比较，计算出杀菌率。
3、表面挑战试验
选用经过处理的载体，将经灭菌的载体平铺于无菌平皿内，用适宜的方法（滴染法、浸染法、喷染法等）滴加适量挑战菌液并用接种环涂匀整个载体表面。滴染菌液后，载体置37℃温箱内干燥约20-30min后备用。用无菌镊子取预先制备的菌片放入平皿中，按照各自消毒程序要求进行消毒操作。待菌药相互作用至规定时间，用无菌镊子将菌片取出分别移入含中和剂的试管作用充分。最终进一步混匀后，进行系列10倍稀释，接种平皿测定存活菌数。
4、消毒程序效力确认
实验室效力验证确定消毒程序的浓度和时间参数后即可进行消毒程序在使用现场的效力确认。
现场考察试验用以评估消毒剂对相应设施的实际消毒效力。此类试验是通过监测清洁（消毒）前后的环境微生物质量进行的。经历一段时间后才能积累用以评估消毒和清洁程序的数据（建议至少3次试验）。为了获得更好的评价结果，可以在最差条件下（如预防性维修之后）检验环境的污染状况，因为此时环境中的微生物种类和数量有上升的潜在可能性。
5、表面消毒效果持续符合确认
连续清洗消毒措施的效果通过环境监控结果的趋势来证明。在洁净室验证过程中，只要监控结果继续保持在已建立的较低水平上，则说明清洁消毒措施是合适的。如果环境监控结果存在重复性的偏离，则调查评估将会导致一个结论，即需要进行重复性的消毒效果验证。


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