技术介绍 | MGI测序原理

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第二代测序（Next-generation sequencing，NGS），又称为高通量测序（High-throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。与一代测序相比，二代测序具有通量高、读长短的特点。目前国内主流的二代测序平台有Illumina和MGI，珠海舒桐公司便是基于MGI（华大智造）测序平台为客户提供测序服务的。测序时，客户只需要提供样本DNA即可。可能有客户不太清楚整个测序流程，今天就和大家分享一下MGI平台的测序原理。

MGI平台的前身是2013年被华大集团收购的美国Complete Genomics测序平台，采用的是DNBSEQTM测序技术。测序流程可大致分成文库构建、DNB制备与加载、上机测序、信息分析这四个部分。



图 1 DNBSEQTM*

文库构建

客户送到的DNA样品需要经过一定的处理才能用于测序，我们把处理后的产物DNA称为“文库（Library）”。根据实验工具和目的的不同，制备DNA文库的方法也多种多样，但基本流程都包括DNA片段化、加接头和单链环化这三步。

1、DNA片段化

我们已经知道高通量测序平台读长相对较短的特点，一般都在500bp以内。因此需要通过机械法或酶切法将DNA打断成200-500bp的长度后才能进行测序。打断的大小需要根据测序时所使用的读长来调整，比如本公司常用的PE150测序读长（Paired End 150，即两端各测150bp），推荐打断后的DNA主带在420bp左右。

但也有例外，如扩增子建库是将目的片段扩增出来做测序，所以只要PCR产物的长度符合要求即可，不需要做基因组DNA的打断。又比如cfDNA片段长度在300bp以内，无需被片段化。

2、加接头

DNA片段化之后，我们需要在DNA两端加上接头（Adapter），这本质上就是一段DNA序列，包含扩增引物、测序引物、标签序列等。其中标签序列也叫index或barcode，一般是10bp左右，每个样品的barcode都是不一样的。前面说过，二代测序通量高，也就是说一次可以测很多DNA，所以我们往往会将不同客户的样本，或同一客户的不同样本混在一起测序以节约成本。在这种情况下，barcode就像一张身份证一样，保证我们知道测出来的序列来自哪一个样本。

3. 单链环化

在Illumina测序平台，加完接头就算建库完成了，这时的文库是双链DNA(double-stranded DNA, dsDNA)。但由于测序原理的不同，MGI平台需要的文库是成环状的单链DNA(single-stranded DNA,ssDNA)。方法是将带有接头序列的dsDNA通过高温变性成ssDNA，并添加DNA连接酶和环化引物（Splint Oligo）使ssDNA两端互补配对连接成环，生成单链环状DNA（ssCirDNA），到这一步，MGI平台的建库才算完成。



图 2 单链环化过程*

DNB制备与加载

制备好的ssCirDNA还不能直接上机，因为测序信号是荧光，而一份ssCirDNA产生的信号太弱，测序仪很难检测到。因此，需要把信号放大，方法也很简单，只要增加ssCirDNA的拷贝数就行。在这里，华大使用的扩增方法是滚环扩增（Rolling Circle Amplification, RCA）技术。ssCirDNA的接头里含有RCA引物结合位点，在引物退火后，DNA聚合酶会沿着ssCirDNA延伸，当到达引物的5’端时，会把引物顶起（使用的DNA聚合酶具有链置换活性），继续沿着ssCirDNA进行旋转延伸，最终就形成了一个DNA纳米球（DNA nanoball, DNB）。所以DNB本质上就是一条很长的单链DNA，只是由于缠绕在一起，形成了一个毛线球的形状。从ssCirDNA到DNB，拷贝数增加了300-500，信号也放大到了足以被测序仪检测到的程度。



图 3 DNB制备示意图*

DNB制备好之后，需要加载到阵列式流动槽（Patterned Array Flow Cell）中。阵列式流动槽中含有很多Spot点，它们经过氨基化修饰，带正电荷，可以与带负电的DNB结合。而非Spot点区域用HDMS修饰，使DNB不能与之结合。由于DNB的直径比Spot点略大，所以一个Spot点只能结合一个DNB。最后，还会对DNB进行蛋白包埋处理，保证DNB不会轻易脱落。



图 4 DNB加载*

测序  

把加载好DNB的阵列式流动槽放入测序仪，即可开始测序，在这里华大采用的是联合探针锚定聚合技术（combinatorial Probe Anchor Synthesis, cPAS）。首先，DNA分子锚和荧光探针在DNB上进行聚合，随后高分辨率成像系统对光信号镜像采集，光信号经过数字化处理后即可获得待测序列。
不同的MGI测序仪使用的测序策略不太一样。本公司使用的MGISEQ2000测序仪，采用四色荧光策略，即ATCG分别被标记上不同的荧光基团，测序时，每个循环捕捉4张图像，用于分析碱基信息。



图 5 四通道荧光*

信息分析

我们知道，测序过程中产生的最原始的数据是大量的图片。测序完成后，测序仪会对这些图片进行分析，识别出碱基信息，形成FASTQ文件和报告，FASTQ文件含有序列信息，报告则反映测序质量。



图 6测序仪对数据的初步分析*

之后，生信部门会对测序数据进行进一步的分析，并给客户出具报告。
舒桐科技拥有专业的生信科研团队，具备一系列测序分析平台以及丰富的基因编辑相关数据分析经验，可提供流程化、模块化、个性定制的生信分析服务。此外，公司搭建了一站式基因编辑平台、分子诊断平台和科技服务平台，可提供从靶点筛选、基因编辑有效性检测到安全性评估的全流程解决方案。如有需求，欢迎咨询！

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